Überblick
Die Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie ist der Eckpfeiler der Proteomik. Der grundlegende Arbeitsablauf umfasst den Verdau von Proteinen in Peptide mithilfe einer Protease wie Trypsin, die Messung der Massen der intakten Peptide (MS1) und anschließend die Fragmentierung ausgewählter Peptide zur Erzeugung von Tandem-Massenspektren (MS/MS), die deren Aminosäuresequenz offenbaren. Die resultierenden Spektren werden mit theoretischen Spektren abgeglichen, die aus Proteinsequenzdatenbanken abgeleitet wurden, um Identitäten zuzuordnen. Dieser Bottom-Up- oder Shotgun-Ansatz ist hoch skalierbar und kann Tausende von Proteinen aus komplexen Gemischen in einem einzigen Experiment identifizieren.
Methoden
Der Peptid-Massenfingerabdruck (PMF) identifiziert Proteine durch Abgleich der Liste experimentell gemessener Peptidmassen mit den theoretischen Peptidmassen aus einer Datenbank. PMF funktioniert am besten für einfache Proteingemische oder gereinigte Proteine, die durch Techniken wie SDS-PAGE getrennt wurden. Die Tandem-MS (MS/MS)-Identifizierung fragmentiert einzelne Peptide, um sequenzinformative Spektren zu erzeugen. Suchmaschinen vergleichen die beobachteten Fragmentionenserien — hauptsächlich b- und y-Ionen — mit vorhergesagten Serien von Kandidatenpeptiden. Die De-novo-Sequenzierung leitet die Peptidsequenz direkt aus dem Spektrum ab, wenn kein Datenbanktreffer gefunden wird, und nutzt die Massendifferenzen zwischen aufeinanderfolgenden Fragmentionen zur Sequenzableitung.
Anwendungen
Die Proteinidentifizierung wird in der gesamten Molekularbiologie und klinischen Forschung eingesetzt. Sie bestätigt die Identität gereinigter Proteine aus der Proteinextraktion und -reinigung, charakterisiert Komponenten von Proteomik- und Massenspektrometrie-Experimenten und identifiziert Proteinkomplexe, die mit einem Köderprotein co-gereinigt wurden. In der Mikrobiologie wird sie zur Identifizierung bakterieller Arten mittels Massenspektrometrie-basiertem Proteotyping eingesetzt und ergänzt damit genomische Ansätze.
