Die Größenausschlusschromatographie (SEC), auch bekannt als Gelpermeationschromatographie (GPC) für organische Polymere oder Gelchromatographie (GFC) für wässrige Systeme, trennt Moleküle basierend auf ihrem hydrodynamischen Volumen und nicht auf chemischer Wechselwirkung mit der stationären Phase. Eine in die Säule eingebrachte Probe wird von der mobilen Phase durch ein Bett aus porösen Kügelchen transportiert. Moleküle, die größer als die größten Poren sind (oberhalb der Ausschlussgrenze), können nicht in die Poren eindringen und eluieren zuerst. Moleküle, die klein genug sind, um das gesamte Porennetzwerk zu durchdringen (unterhalb der Permeationsgrenze), eluieren zuletzt. Zwischen diesen Grenzen eluieren Moleküle in der Reihenfolge abnehmender Größe.
Die stationäre Phase besteht aus vernetzten Polymerkügelchen mit kontrollierter Porengrößenverteilung. Übliche Materialien umfassen Polystyrol-Divinylbenzol für organische SEC, Dextran (Sephadex), Agarose (Sepharose) und Polyacrylamid für wässrige SEC. Die Porengröße wird basierend auf dem Molekulargewichtsbereich des Analyten ausgewählt; Säulen mit unterschiedlichen Porengrößen können in Reihe geschaltet werden, um den Trennbereich zu erweitern. Die Partikelgröße beeinflusst sowohl die Auflösung als auch den Gegendruck, wobei kleinere Partikel (3–5 µm) eine höhere Effizienz bieten.
Die Molekulargewichtskalibrierung erfolgt mit engverteilten Polymerstandards bekannten Molekulargewichts, typischerweise Polystyrol, Poly(methylmethacrylat) oder Poly(ethylenglycol), abhängig vom Probentyp. Die Kalibrierkurve trägt log(Mw) gegen das Elutionsvolumen auf. Aus dem Chromatogramm werden mittlere Molekulargewichte berechnet: Zahlenmittel (Mn), Gewichtsmittel (Mw) und Peaks Molekulargewicht (Mp). Der Polydispersitätsindex (PDI = Mw/Mn) gibt die Breite der Molekulargewichtsverteilung an, wobei PDI = 1 für monodisperse Proben gilt.
Die Anwendungen der SEC konzentrieren sich auf die Polymercharakterisierung, einschließlich der Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung, der Überwachung der Polymerisationskinetik und der Analyse der Copolymerzusammensetzung. SEC wird auch in der Biochemie für die Proteinreinigung und Entsalzung (Pufferaustausch), in der Lebensmittelindustrie zur Analyse von Polysacchariden und Proteinen und in der petrochemischen Analyse zur Charakterisierung schwerer Fraktionen eingesetzt. Die wässrige SEC (GFC) wird häufig zur Analyse wasserlöslicher Polymere, Proteine und Nukleinsäuren unter nicht-denaturierenden Bedingungen verwendet.
Einschränkungen der SEC müssen bei der Methodenentwicklung berücksichtigt werden. Nicht-Größenausschlusseffekte wie elektrostatische Wechselwirkungen (Ionenausschluss oder Ioneneinschluss an geladenen stationären Phasen) und hydrophobe Adsorption können die Elutionsprofile verfälschen. Die Probenkonzentration muss niedrig gehalten werden (typischerweise < 2 mg/mL), um Viskositätsfingering und Überladungseffekte zu vermeiden. Die Säulenauswahl ist kritisch: Die Porengröße muss dem Molekulargewichtsbereich der Probe entsprechen, und die Flussraten müssen moderat gehalten werden (0,5–1,0 mL/min), um Scherdegradation von hochmolekularen Polymeren zu minimieren.
