La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), también conocida como cromatografía de permeación en gel (GPC) para polímeros orgánicos o cromatografía de filtración en gel (GFC) para sistemas acuosos, separa moléculas según su volumen hidrodinámico en lugar de su interacción química con la fase estacionaria. Una muestra introducida en la columna es transportada por la fase móvil a través de un lecho de partículas porosas. Las moléculas más grandes que los poros más grandes (por encima del límite de exclusión) no pueden entrar en los poros y eluyen primero. Las moléculas lo suficientemente pequeñas para penetrar toda la red de poros (por debajo del límite de permeación) eluyen al final. Entre estos límites, las moléculas eluyen en orden de tamaño decreciente.
La fase estacionaria consiste en partículas poliméricas reticuladas con distribuciones controladas de tamaño de poro. Los materiales comunes incluyen poliestireno-divinilbenceno para SEC orgánica, dextrano (Sephadex), agarosa (Sepharose) y poliacrilamida para SEC acuosa. El tamaño de poro se selecciona según el rango de peso molecular del analito; las columnas con diferentes tamaños de poro pueden conectarse en serie para extender el rango de separación. El tamaño de partícula influye tanto en la resolución como en la contrapresión, proporcionando partículas más pequeñas (3-5 µm) una mayor eficiencia.
La calibración de peso molecular se realiza utilizando estándares de polímero de distribución estrecha y peso molecular conocido, típicamente poliestireno, poli(metacrilato de metilo) o poli(etilenglicol), dependiendo del tipo de muestra. La curva de calibración representa log(Mw) frente al volumen de elución. A partir del cromatograma, se calculan los pesos moleculares promedio: promedio numérico (Mn), promedio ponderal (Mw) y peso molecular del pico (Mp). El índice de polidispersidad (PDI = Mw/Mn) indica la amplitud de la distribución de pesos moleculares, con PDI = 1 para muestras monodispersas.
Las aplicaciones de la SEC se centran en la caracterización de polímeros, incluyendo la determinación de la distribución de pesos moleculares, el monitoreo de la cinética de polimerización y el análisis de la composición de copolímeros. La SEC también se emplea en bioquímica para la purificación de proteínas y desalinización (intercambio de tampón), en la industria alimentaria para el análisis de polisacáridos y proteínas, y en el análisis petroquímico para la caracterización de fracciones pesadas. La SEC acuosa (GFC) se utiliza ampliamente para analizar polímeros solubles en agua, proteínas y ácidos nucleicos en condiciones no desnaturalizantes.
Las limitaciones de la SEC deben considerarse durante el desarrollo del método. Los efectos no relacionados con la exclusión por tamaño, como las interacciones electrostáticas (exclusión o inclusión iónica en fases estacionarias cargadas) y la adsorción hidrofóbica, pueden distorsionar los perfiles de elución. La concentración de la muestra debe mantenerse baja (típicamente < 2 mg/mL) para evitar la digitación viscosa y los efectos de sobrecarga. La elección de la columna es crítica: el tamaño de poro debe coincidir con el rango de peso molecular de la muestra, y los caudales deben mantenerse moderados (0,5-1,0 mL/min) para minimizar la degradación por cizallamiento de polímeros de alto peso molecular.
