Kromatografi eksklusi ukuran (SEC), juga dikenal sebagai kromatografi permeasi gel (GPC) untuk polimer organik atau kromatografi filtrasi gel (GFC) untuk sistem akuatik, memisahkan molekul berdasarkan volume hidrodinamik-nya daripada interaksi kimia dengan fase diam. Sampel yang dimasukkan ke dalam kolom dibawa oleh fase gerak melalui hamparan manik-manik berpori. Molekul yang lebih besar dari pori terbesar (di atas batas eksklusi) tidak dapat memasuki pori dan terelusi pertama. Molekul yang cukup kecil untuk menembus seluruh jaringan pori (di bawah batas permeasi) terelusi terakhir. Di antara batas-batas ini, molekul terelusi dalam urutan ukuran yang menurun.
Fase diam terdiri dari manik-manik polimer ikatan silang dengan distribusi ukuran pori yang terkontrol. Material umum meliputi polistirena-divinilbenzena untuk SEC organik, dekstran (Sephadex), agarosa (Sepharose), dan poliakrilamida untuk SEC akuatik. Ukuran pori dipilih berdasarkan rentang berat molekul analit; kolom dengan ukuran pori yang berbeda dapat dihubungkan secara seri untuk memperluas rentang pemisahan. Ukuran partikel memengaruhi resolusi dan tekanan balik, dengan partikel yang lebih kecil (3-5 µm) memberikan efisiensi yang lebih tinggi.
Kalibrasi berat molekul dilakukan menggunakan standar polimer distribusi sempit dengan berat molekul yang diketahui, biasanya polistirena, poli(metil metakrilat), atau poli(etilena glikol), tergantung pada jenis sampel. Kurva kalibrasi memplot log(Mw) terhadap volume elusi. Dari kromatogram, berat molekul rata-rata dihitung: rata-rata jumlah (Mn), rata-rata berat (Mw), dan berat molekul puncak (Mp). Indeks polidispersitas (PDI = Mw/Mn) menunjukkan luas distribusi berat molekul, dengan PDI = 1 untuk sampel monodispers.
Aplikasi SEC berpusat pada karakterisasi polimer, termasuk penentuan distribusi berat molekul, pemantauan kinetika polimerisasi, dan analisis komposisi kopolimer. SEC juga digunakan dalam biokimia untuk pemurnian protein dan penghilangan garam (pertukaran buffer), dalam industri makanan untuk menganalisis polisakarida dan protein, dan dalam analisis petrokimia untuk mengkarakterisasi fraksi berat. SEC akuatik (GFC) banyak digunakan untuk menganalisis polimer larut air, protein, dan asam nukleat dalam kondisi non-denaturasi.
Keterbatasan SEC harus dipertimbangkan selama pengembangan metode. Efek non-eksklusi ukuran seperti interaksi elektrostatik (eksklusi ion atau inklusi ion pada fase diam bermuatan) dan adsorpsi hidrofobik dapat mendistorsi profil elusi. Konsentrasi sampel harus dijaga rendah (biasanya < 2 mg/mL) untuk menghindari efek viscous fingering dan kelebihan muatan. Pemilihan kolom sangat penting: ukuran pori harus sesuai dengan rentang berat molekul sampel, dan laju alir harus dijaga moderat (0,5-1,0 mL/menit) untuk meminimalkan degradasi geser polimer dengan berat molekul tinggi.
