La hibridación in situ (HIS) es una técnica que utiliza sondas de ácidos nucleicos marcadas para detectar secuencias específicas de ADN o ARN directamente en secciones de tejido o preparaciones citológicas. A diferencia de los métodos moleculares basados en extracción (PCR, secuenciación), la HIS preserva la arquitectura tisular y muestra exactamente qué células contienen la secuencia diana.

Principios

La HIS utiliza una sonda — una molécula de ADN o ARN monocatenario complementaria a la secuencia diana. La sonda está marcada con un marcador detectable (isótopo radiactivo, fluoróforo, hapteno). Después de la desnaturalización del ADN diana (para HIS de ADN) o sin desnaturalización (para HIS de ARN), la sonda hibrida con la secuencia diana bajo condiciones controladas de temperatura y salinidad. La sonda no unida se elimina mediante lavado, y la sonda unida se detecta mediante autorradiografía, microscopía de fluorescencia o detección cromogénica basada en enzimas.

Estringencia — la especificidad de la hibridación se controla mediante temperatura y concentración de sal. La alta estringencia (alta temperatura, baja salinidad) permite que solo se formen híbridos sonda-diana perfectamente emparejados. Menor estringencia permite emparejamientos parciales, lo que puede ser deseable para detectar secuencias relacionadas pero aumenta el fondo.

Hibridación In Situ por Fluorescencia (FISH)

La FISH utiliza sondas marcadas con fluoróforos detectadas por microscopía de fluorescencia. Es el método de HIS más utilizado en patología diagnóstica. Las sondas FISH incluyen: sondas de enumeración centromérica (CEP) — se dirigen al ADN satélite alfa específico del cromosoma en los centrómeros, usadas para detectar aneuploidía; sondas indicadoras de locus específico (LSI) — se dirigen a secuencias únicas en loci cromosómicos específicos, usadas para detectar amplificación génica (HER2, EGFR) y deleción (1p/19q en oligodendroglioma); sondas de separación (break-apart) — pares de sondas que flanquean un locus génico; la separación indica translocación (ALK, ROS1, MYC, BCL2, BCL6, MALT1); sondas de fusión — una sonda en cada lado de un punto de ruptura de translocación; las señales de fusión indican la translocación.

FISH de HER2 — el estándar de oro para la determinación del estado de HER2 en cáncer de mama y gástrico. Una relación de señales de HER2 (17q12) a señales de CEP17 >2.0 está amplificada. La FISH se realiza cuando la IHQ es equívoca (puntuación 2+).

FISH de ALK — FISH de separación para el reordenamiento de ALK (2p23) en adenocarcinoma de pulmón detecta pacientes que responden a inhibidores de ALK (crizotinib, alectinib). La IHQ de ALK (clon D5F3) ha reemplazado en gran medida a la FISH como prueba de cribado primaria, pero la FISH sigue siendo el método de confirmación.

Hibridación In Situ Cromogénica (CISH)

La CISH utiliza sondas marcadas con hapteno detectadas mediante una reacción cromogénica basada en enzimas (DAB para marrón, Fast Red para rojo). La señal es visible bajo un microscopio de campo claro, permitiendo la evaluación simultánea de la morfología y la señal de hibridación. La CISH es más barata que la FISH (no requiere microscopio de fluorescencia), produce portaobjetos permanentes y es más accesible en los laboratorios de histopatología rutinaria.

Hibridación In Situ de ARN

La HIS de ARN detecta transcritos específicos de ARNm en secciones de tejido. RNAscope (Advanced Cell Diagnostics) es una tecnología de HIS de ARN disponible comercialmente que utiliza una estrategia de diseño de sondas (sondas Z dobles) que elimina el fondo por unión inespecífica de la sonda. Cada ARNm diana aparece como una señal puntiforme en el citoplasma (o núcleo para transcritos nacientes). RNAscope es hasta 100 veces más sensible que la HIS de ARN tradicional y puede detectar tan solo 1-2 copias de ARNm por célula.

Las aplicaciones de la HIS de ARN incluyen: detección de ARN viral (EBV EBER — el método estándar para identificar células infectadas por EBV en linfoma de Hodgkin, trastornos linfoproliferativos postrasplante, carcinoma nasofaríngeo); ARN de VPH (detección de ARNm de E6/E7 confirma infección por VPH transcripcionalmente activa); análisis de expresión génica (ARNm de PD-L1, expresión de citocinas en infiltrados inflamatorios); determinación de linaje (detección de transcritos específicos de tejido en tumores pobremente diferenciados).

Aplicaciones Diagnósticas

Diagnóstico de linfoma — FISH para translocaciones de MYC, BCL2 y BCL6 en linfoma difuso de células B grandes (linfomas doble y triple hit). EBER HIS para EBV en linfoma de Hodgkin y trastorno linfoproliferativo postrasplante.

Diagnóstico de sarcoma — FISH para SS18 (sarcoma sinovial), FKHR (rabdomiosarcoma alveolar), EWSR1 (sarcoma de Ewing, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas) y MDM2 (liposarcoma bien diferenciado/dediferenciado).

Cáncer de pulmón — FISH de ALK, FISH de ROS1 y FISH de amplificación de MET para selección de terapia dirigida.

Cáncer de mama — FISH de HER2 para casos de IHQ equívoca.

Limitaciones

La FISH requiere microscopía de fluorescencia y software especializado para el recuento de señales. La penetración de la sonda en secciones de tejido grueso puede ser incompleta. Desvanecimiento de la señal — los fluoróforos se fotoblanquean con excitación prolongada; los portaobjetos deben almacenarse en la oscuridad. Desafíos de interpretación incluyen núcleos seccionados (artefactos de truncamiento en secciones de parafina pueden eliminar señales — usar secciones de 4 µm), señales superpuestas y polisomía. Degradación del ARN en tejido mal preservado causa HIS de ARN falsa negativa. El aseguramiento de la calidad incluye validación regular con controles positivos y negativos conocidos, participación en programas de ECA y criterios de interpretación documentados.