L’immunoprécipitation de la chromatine est une méthode de cartographie des interactions protéine-ADN dans le génome. Elle identifie les sites de liaison génomiques des facteurs de transcription, des histones avec des modifications spécifiques et d’autres protéines associées à la chromatine, fournissant des informations sur la régulation génique et la structure de la chromatine.

Principe de base

Le ChIP commence par la réticulation des protéines à l’ADN dans des cellules vivantes, généralement en utilisant le formaldéhyde qui crée des liaisons covalentes entre les protéines et l’ADN à quelques angstroms près. La chromatine réticulée est fragmentée en morceaux de 200 à 600 paires de bases par sonication ou digestion enzymatique. Un anticorps spécifique de la protéine d’intérêt est utilisé pour immunoprécipiter les complexes protéine-ADN. Les réticulations sont inversées, et l’ADN est purifié. Les fragments d’ADN enrichis sont ensuite identifiés par PCR quantitative, puce à ADN ou séquençage.

Réticulation

La réticulation au formaldéhyde est la méthode standard, créant des ponts méthylène entre les groupes aminés en interaction étroite. Elle est réversible par la chaleur et est efficace pour les protéines qui contactent directement l’ADN. Pour les protéines qui se lient indirectement ou faiblement à l’ADN, des réticulants alternatifs tels que l’EGS peuvent être utilisés. Le ChIP natif omet la réticulation et fonctionne pour les protéines étroitement liées telles que les histones.

Fragmentation de la chromatine

La sonication produit des fragments d’ADN aléatoires par cisaillement mécanique. La distribution de taille des fragments est critique, car des fragments plus petits fournissent une résolution plus élevée des sites de liaison. Les conditions de sonication doivent être optimisées pour chaque type cellulaire pour éviter un sur-cisaillement ou un sous-cisaillement. La digestion enzymatique par la nucléase micrococcale est une alternative pour le ChIP natif, clivant l’ADN entre les nucléosomes.

Immunoprécipitation

Le succès du ChIP dépend de la qualité de l’anticorps. L’anticorps doit reconnaître sa cible dans la chromatine réticulée avec une spécificité et une affinité élevées. Les anticorps de qualité ChIP sont validés pour cette application. Des billes d’agarose de protéine A ou de protéine G ou des billes magnétiques sont utilisées pour capturer les complexes anticorps-chromatine. Les billes magnétiques sont préférées pour un bruit de fond plus faible et un traitement plus rapide.

ChIP-qPCR

Pour les gènes cibles connus, la ChIP-qPCR (PCR quantitative) quantifie l’enrichissement à des régions génomiques spécifiques. Les amorces sont conçues pour le site de liaison suspecté et pour une région de contrôle négatif. L’enrichissement est calculé comme l’augmentation par rapport au contrôle négatif ou à la chromatine d’entrée. La ChIP-qPCR est sensible, quantitative et adaptée aux études basées sur des hypothèses de loci sélectionnés.

ChIP-on-Chip

Le ChIP sur puce hybride l’ADN enrichi par ChIP sur des puces à ADN couvrant les régions génomiques d’intérêt. L’ADN d’entrée est marqué avec un fluorophore et l’ADN ChIP avec un autre. Les régions génomiques avec des rapports élevés correspondent aux sites de liaison. La résolution est limitée par la taille des fragments et l’espacement des sondes. Le ChIP-on-chip a été largement remplacé par le ChIP-seq.

ChIP-Séquençage

Le ChIP-seq combine le ChIP avec le séquençage de nouvelle génération. Les fragments d’ADN immunoprécipités sont séquencés, et les lectures sont alignées sur le génome de référence. Les régions avec un enrichissement significatif des lectures, appelées pics, indiquent les sites de liaison des protéines. Le ChIP-seq fournit une résolution plus élevée, un bruit plus faible et une couverture pangénomique sans nécessiter de sondes prédéfinies. Les algorithmes d’appel de pics tels que MACS identifient les régions où la densité de lecture dépasse significativement la distribution de fond.

Analyse des données

L’analyse des données ChIP-seq commence par le contrôle qualité, l’alignement des lectures et l’élimination des duplicats PCR. L’appel de pics identifie les régions enrichies en utilisant un modèle de Poisson ou binomial négatif. La correction pour tests multiples contrôle le taux de fausses découvertes. L’analyse en aval comprend l’annotation des pics aux gènes voisins, la découverte de motifs pour identifier les préférences de séquence et la comparaison entre conditions.

Applications

Le ChIP-seq cartographie les sites de liaison des facteurs de transcription à l’échelle du génome, révélant les réseaux de régulation qui contrôlent l’expression génique. Il cartographie les profils de modification des histones qui définissent les promoteurs actifs, les enhancers et la chromatine réprimée. Le ChIP-seq pour l’ARN polymérase II identifie les gènes transcrits et les polymérases en pause. Les projets ENCODE et Roadmap Epigenomics ont généré des milliers d’ensembles de données ChIP-seq, créant des cartes complètes du paysage régulateur du génome humain.