Aperçu
La phosphoprotéomique est l’étude à grande échelle de la phosphorylation des protéines – l’une des modifications post-traductionnelles les plus répandues et les plus importantes sur le plan fonctionnel. La phosphorylation régule presque tous les aspects de la vie cellulaire, y compris l’activité enzymatique, les interactions protéine-protéine, la localisation subcellulaire et la transduction du signal. La phosphoprotéomique vise à identifier quelles protéines sont phosphorylées, sur quels résidus (principalement sérine, thréonine et tyrosine) et comment l’état de phosphorylation change en réponse à des stimuli. Le domaine combine des stratégies d’enrichissement en phosphopeptides avec une spectrométrie de masse à haute résolution et une bioinformatique spécialisée pour cartographier le phosphoprotéome à une profondeur sans précédent.
Concepts clés
L’enrichissement en phosphopeptides est essentiel car les peptides phosphorylés sont généralement sous-stoechiométriques par rapport à leurs homologues non phosphorylés. Les méthodes d’enrichissement courantes comprennent la chromatographie d’affinité sur métal immobilisé (IMAC) et la chromatographie sur dioxyde de titane (TiO2), qui exploitent toutes deux l’affinité des groupes phosphate pour les oxydes métalliques. Les algorithmes de localisation de site tels qu’Ascore, Mascot Delta Score et la probabilité de localisation de MaxQuant déterminent le résidu exact qui transporte le phosphate. L’analyse des motifs identifie les modèles de séquence autour des sites de phosphorylation pour déduire les préférences de kinases en amont. Les relations kinase-substrat peuvent être prédites à partir de ces motifs et validées expérimentalement.
Protocole pratique
Un flux de travail phosphoprotéomique standard commence par l’extraction et la digestion des protéines. Les cellules ou les tissus sont lysés dans un tampon dénaturant contenant des inhibiteurs de la phosphatase (par exemple, orthovanadate de sodium, bêta-glycérophosphate) pour préserver l’état de phosphorylation. Les protéines sont digérées avec de la trypsine pendant la nuit et le mélange peptidique résultant est dessalé à l’aide de cartouches C18. L’étape critique d’enrichissement suit : le mélange peptidique est chargé sur une colonne TiO2 ou IMAC, où les phosphopeptides se lient via leurs groupes phosphate à l’oxyde métallique ou aux ions métalliques immobilisés. Les peptides non phosphorylés sont éliminés avec des tampons contenant 80 % d’acétonitrile et 0,5 % d’acide trifluoroacétique, tandis que les phosphopeptides sont élués à l’aide d’un tampon phosphate alcalin ou d’une solution d’ammoniaque à 5 %. La fraction enrichie est analysée par LC-MS/MS ou CE-MS en utilisant électrophorèse de zone capillaire sur un spectromètre de masse Orbitrap haute résolution. Les données brutes sont traitées à l’aide de MaxQuant avec la phosphorylation de la sérine, de la thréonine et de la tyrosine définies comme modifications variables. Les scores de probabilité de localisation du site de MaxQuant déterminent le résidu phosphorylé exact. L’analyse en aval comprend l’enrichissement de motifs à l’aide d’outils tels que IceLogo pour identifier les séquences consensus de kinases et l’inférence de réseau kinase-substrat à l’aide de l’analyse d’enrichissement de substrat kinase (KSEA). Dans une application réelle, ce flux de travail a cartographié plus de 20 000 phosphosites dans des cellules HeLa stimulées par l’EGF, révélant une phosphorylation dynamique du réseau de signalisation EGFR quelques minutes après la stimulation. Un autre exemple est la cartographie systématique du phosphoprotéome de réponse aux dommages de l’ADN, où 5 000 phosphosites régulés ont identifié les substrats des kinases ATM et ATR essentiels à l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire et à la réparation de l’ADN.
### Candidatures
La phosphoprotéomique est essentielle à la compréhension des réseaux de signalisation cellulaire. Il a cartographié les cascades de signalisation en aval des récepteurs tyrosine kinases et des récepteurs couplés aux protéines G, révélé une diaphonie avec les voies du second messager et élucidé le JAK-STAT signalisation. Dans la recherche sur le cancer, la phosphoprotéomique identifie des kinases aberrantes qui peuvent servir de cibles thérapeutiques, permettant des approches oncologiques de précision qui associent les inhibiteurs aux nœuds de signalisation dérégulés qui entraînent la croissance tumorale.
