Aperçu
La protéomique descendante analyse les protéines intactes par spectrométrie de masse sans digestion enzymatique préalable. Contrairement à l’approche ascendante conventionnelle qui déduit les identités des protéines à partir des peptides, la protéomique descendante mesure la masse intacte d’une protéine et la fragmente ensuite à l’intérieur du spectromètre de masse pour obtenir des informations sur la séquence. Cette approche préserve le contexte protéique complet, ce qui signifie que les combinaisons de modifications post-traductionnelles, de variantes de séquence et de formes d’épissage alternatives - collectivement appelées protéoformes - sont observées comme des espèces moléculaires distinctes. La protéomique descendante fournit donc une vue directe et sans ambiguïté du paysage protéoforme qui est largement invisible pour les méthodes ascendantes.
Méthodes
Les ions protéiques intacts sont introduits dans le spectromètre de masse via une ionisation par électrospray, qui génère une enveloppe d’état de charge à partir de laquelle la masse moléculaire est calculée. La Fragmentation est obtenue à l’aide de techniques telles que la dissociation par capture d’électrons (ECD) ou la dissociation par transfert d’électrons (ETD), qui clive préférentiellement le squelette protéique tout en préservant les modifications labiles telles que la phosphorylation et la glycosylation. L’identification des protéoformes repose sur des algorithmes qui font correspondre la masse intacte et les ions fragmentés mesurés avec une base de données de protéoformes prédites. Les spectromètres de masse à ultra haute résolution tels que les instruments de résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier (FT-ICR) et Orbitrap sont essentiels pour résoudre les petites différences de masse entre les protéoformes associées.
Protocole pratique
Un flux de travail protéomique descendant pratique commence par l’extraction de protéines intactes dans des conditions dénaturantes en utilisant de l’urée 8 M ou 5 % de SDS pour assurer une solubilisation complète. Les protéines sont séparées au niveau intact par HPLC en phase inverse ou [électrophorèse de zone capillaire] (/guides/électrophorèse de zone capillaire) (CZE) couplée via ionisation par électrospray à un spectromètre de masse Orbitrap ou FT-ICR haute résolution. L’instrument acquiert un balayage MS complet sur une large plage de masses (m/z 400 à 2 000), produisant une enveloppe d’état de charge pour chaque espèce protéique. Le chercheur déconvolutionne l’enveloppe à l’aide d’algorithmes tels que MS-Deconv ou UniDec pour calculer la masse monoisotopique neutre avec une précision inférieure au Da. Pour la fragmentation, l’état de charge le plus abondant est isolé et dissocié par dissociation par transfert d’électrons (ETD), qui préserve les modifications labiles telles que la phosphorylation et la glycosylation. Les spectres de fragments résultants sont recherchés dans une base de données de protéoformes prédites à l’aide de ProSightPC ou TopPIC, qui font correspondre les ions de masse et de fragment intacts à des protéoformes spécifiques définies par séquence, modifications et variantes de séquence. La quantification est effectuée en comparant les intensités relatives des enveloppes d’état de charge dans différentes conditions. Dans une étude historique, la protéomique descendante a caractérisé plus de 3 000 protéoformes de cellules humaines, dont 150 espèces distinctes de la protéine histone H4 seule, chacune portant différentes combinaisons de marques de méthylation et d’acétylation. Une autre application est l’analyse des protéoformes d’anticorps : la MS descendante a révélé plus de 100 variantes distinctes d’anticorps monoclonaux à partir d’un seul lot de production, permettant le contrôle de la qualité dans la fabrication biopharmaceutique et garantissant la cohérence d’un lot à l’autre pour les anticorps thérapeutiques.
### Candidatures
La protéomique descendante excelle dans la caractérisation des modifications post-traductionnelles et de leurs modèles combinatoires sur des protéines individuelles. Il est utilisé pour étudier les codes de modification des histones, l’hétérogénéité des anticorps et les produits de dégradation des protéines. L’approche complète la [protéomique et la spectrométrie de masse] ascendante (/guides/proteomics-and-mass-spectrometry.html) et bénéficie de la même instrumentation [spectrométrie de masse] (/guides/mass-spectrometry.html), tout en fournissant des informations uniques sur la biologie des protéoformes qui sont essentielles à la compréhension des mécanismes de la maladie et au développement de thérapies de précision.
