Amiloid, pigmen, dan endapan mineral terakumulasi dalam jaringan pada berbagai penyakit. Identifikasi histokimia mereka memberikan diagnosis spesifik yang sering tidak dapat dibuat oleh teknik lain.
Congo Red untuk Amiloid
Congo Red adalah pewarnaan histokimia standar untuk amiloid. Dalam larutan alkalin, Congo Red berikatan dengan struktur lembaran beta-terlipat dari fibril amiloid melalui interkalasi antara untaian-beta yang berdekatan. Di bawah mikroskopi medan terang, deposit amiloid berwarna merah muda salmon hingga merah. Temuan diagnostik adalah birefringensi hijau-apel di bawah polarisator bersilang — hasil dari molekul Congo Red yang sejajar di sepanjang fibril amiloid, yang sendiri tersusun dalam susunan birefringen yang sangat teratur.
Tipe amiloid (AL, AA, ATTR, Aβ, dll.) tidak dapat dibedakan oleh Congo Red saja — IHC untuk subtipe amiloid (rantai ringan kappa dan lambda, serum amiloid A, transthyretin, beta-amiloid) atau spektrometri massa diperlukan untuk pengetikan. Sensitivitas Congo Red tinggi untuk deposit besar tetapi mungkin melewatkan deposit awal atau kecil — periksa beberapa irisan di bawah polarisasi. Pengikatan Congo Red positif palsu dapat terjadi pada serat elastis, kolagen, dan hialin — hanya birefringensi hijau-apel yang mengkonfirmasi amiloid.
Thioflavin T
Thioflavin T adalah pewarna fluoresen yang berikatan dengan amiloid dan menunjukkan fluoresensi yang ditingkatkan dengan pergeseran emisi karakteristik. Ini lebih sensitif daripada Congo Red untuk mendeteksi deposit amiloid kecil tetapi memerlukan mikroskop fluoresens dan kurang spesifik. Congo Red tetap menjadi standar emas untuk diagnosis amiloid.
Perls’ Prussian Blue untuk Besi
Perls’ Prussian Blue mendeteksi besi ferri (Fe3+) dalam irisan jaringan. Irisan diperlakukan dengan asam klorida dan kalium ferosianida; ion ferri bereaksi dengan ferosianida untuk membentuk Prussian blue tak larut (ferri ferosianida). Reaksi menghasilkan endapan biru di lokasi besi. Latar belakang biasanya di-counterstain dengan nuclear fast red.
Pewarnaan Perls mengidentifikasi hemosiderin (feritin teragregasi) pada kondisi kelebihan besi: hemokromatosis herediter (besi hepatosit), siderosis terkait transfusi, penyakit hati alkoholik, dan anemia hemolitik. Di sumsum tulang, Perls menilai besi yang dapat diwarnai (skala 0-6). Di paru, Perls menunjukkan sel gagal jantung (makrofag sarat hemosiderin) pada kongesti paru dan mengkonfirmasi hemosiderosis paru. Di limpa dan kelenjar getah bening, deposisi besi setelah perdarahan atau infark mudah diidentifikasi.
Von Kossa untuk Kalsium
Pewarnaan Von Kossa mendeteksi deposit kalsium dengan mensubstitusi ion perak untuk kalsium dalam garam kalsium tak larut (fosfat, karbonat). Di bawah sinar ultraviolet atau cahaya terang, perak direduksi menjadi perak metalik, tampak hitam atau coklat. Latar belakang di-counterstain dengan nuclear fast red atau van Gieson.
Von Kossa digunakan untuk menunjukkan kalsifikasi patologis: kalsifikasi distrofik pada jaringan nekrotik, tumor (badan psammoma pada meningioma, karsinoma tiroid papiler, karsinoma ovarium serosa), katup jantung terkalsifikasi, dan tendinitis kalsifik. Ini juga mengidentifikasi kalsifikasi metastatik (deposisi kalsium di jaringan normal akibat hiperkalsemia) di ginjal, paru, dan mukosa lambung. Von Kossa tidak mendeteksi kalsium oksalat — untuk oksalat, gunakan Alizarin Red S pada pH 4,0 atau cahaya terpolarisasi (kristal oksalat bersifat birefringen).
Alizarin Red S untuk Kalsium
Alizarin Red S membentuk endapan oranye-merah dengan ion kalsium pada pH alkalin (4,0-4,5). Ini lebih spesifik untuk kalsium daripada Von Kossa dan mendeteksi kalsium fosfat dan kalsium oksalat. Alizarin Red digunakan untuk mengidentifikasi deposit kalsium di jaringan lunak, kalsifikasi vaskular, dan nefrokalsinosis. Ini juga merupakan pewarnaan standar untuk mengidentifikasi kalsium dalam irisan histologis tulang dan gigi.
Pewarnaan Bilirubin dan Empedu
Pewarnaan Fouchet (asam trikloroasetat dan ferri klorida) mengoksidasi bilirubin menjadi biliverdin hijau, kemudian hijau/biru ke warna hijau zamrud empedu. Ini digunakan untuk mengidentifikasi kolestasis intrahepatik dan ekstrahepatik pada biopsi hati dan trombus empedu di kanalikuli. Pewarnaan Hall (Van Gieson dengan Fouchet) secara simultan mewarnai empedu (hijau/biru) dan kolagen (merah). Pigmen empedu harus dibedakan dari lipofuscin (pigmen usia) dan hemosiderin — Perls mewarnai besi biru, dan PAS mewarnai lipofuscin secara bervariasi.
Pemutih Melanin
Melanin adalah pigmen coklat-hitam endogen yang dapat mengaburkan detail seluler dan interpretasi IHC. Pemutih melanin (kalium permanganat diikuti asam oksalat) menghilangkan melanin tanpa merusak morfologi jaringan atau antigenisitas, memungkinkan evaluasi detail seluler di bawah deposit melanin yang tebal. Irisan yang diputihkan dapat digunakan untuk IHC setelah optimalisasi protokol.
Kontrol Mutu
Setiap pewarnaan khusus memerlukan kontrol positif yang sesuai yang dijalankan bersamaan: jaringan mengandung amiloid (Congo Red), hati kelebihan besi (Perls’), arteri terkalsifikasi (Von Kossa), dan hati diwarnai empedu (Fouchet). Kegagalan kontrol membatalkan proses. Prosedur pemecahan masalah standar berlaku — jika kontrol lemah, periksa kesegaran reagen, pH, dan waktu inkubasi.
