PCR digital (dPCR) adalah penyempurnaan dari PCR konvensional yang memberikan kuantifikasi absolut asam nukleat tanpa memerlukan kurva standar. Sampel dipartisi menjadi ribuan reaksi individu kecil, dan setelah amplifikasi, jumlah partisi positif versus negatif dihitung.
Cara Kerja PCR Digital
- Partisi
Campuran PCR yang mengandung sampel, primer, probe, dan polimerase dibagi menjadi ribuan partisi berukuran nanoliter. Ini dapat dilakukan menggunakan chip dengan sumur mikro, tetesan dalam emulsi minyak (droplet digital PCR), atau metode lainnya. Setiap partisi mengandung nol atau setidaknya satu salinan DNA target.
- Amplifikasi
Sampel yang dipartisi mengalami siklus termal standar. Di setiap partisi, PCR berlangsung secara independen. Partisi yang mengandung DNA target menghasilkan produk yang diamplifikasi, sementara partisi kosong tidak menghasilkan apa-apa.
- Deteksi Titik Akhir
Setelah amplifikasi, setiap partisi dianalisis untuk fluoresensi. Partisi yang mengandung DNA target yang diamplifikasi diberi skor positif (fluoresen), sementara yang tanpa diberi skor negatif. Tidak diperlukan siklus kuantifikasi (Ct) — ini hanya pembacaan ya-atau-tidak per partisi.
- Statistik Poisson
Karena partisi bersifat acak, beberapa partisi mungkin mengandung beberapa salinan target. Statistik Poisson digunakan untuk menghitung jumlah absolut molekul target dalam sampel asli berdasarkan proporsi partisi negatif.
- Aplikasi
PCR digital sangat presisi dan digunakan untuk mengkuantifikasi mutasi langka, mendeteksi patogen dengan kelimpahan rendah, menganalisis variasi jumlah salinan, dan memverifikasi hasil NGS. Ia kurang sensitif terhadap inhibitor PCR dibandingkan qPCR dan memberikan kuantifikasi absolut tanpa standar.
