Microarray DNA memungkinkan pengukuran simultan tingkat ekspresi ribuan gen, memberikan pandangan seluruh genom tentang aktivitas transkripsi seluler. Mereka merevolusi genomik fungsional dengan memungkinkan peneliti membandingkan ekspresi gen antara kondisi, jaringan, atau keadaan penyakit yang berbeda.

Prinsip Microarray

Microarray DNA terdiri dari ribuan titik mikroskopis, masing-masing mengandung probe sekuens DNA spesifik, dilekatkan ke permukaan padat seperti slide kaca atau chip silikon. Setiap probe dirancang untuk berhibridisasi dengan mRNA target spesifik atau sekuens cDNA. Seluruh kumpulan probe mewakili kumpulan gen yang dianalisis.

Eksperimen dasar melibatkan ekstraksi RNA dari sampel yang diminati, mengonversinya menjadi DNA komplementer dengan transkriptase balik, melabeli cDNA dengan pewarna fluoresen, dan menghibridisasi cDNA berlabel ke microarray. Setelah mencuci materi yang terikat secara non-spesifik, intensitas fluoresensi pada setiap titik diukur, menunjukkan jumlah setiap mRNA dalam sampel asli.

Array Dua-Warna

Dalam eksperimen microarray dua-warna, RNA dari dua kondisi dilabeli dengan pewarna fluoresen yang berbeda, biasanya Cy3 dan Cy5. cDNA berlabel dicampur dan dihibridisasi ke satu array. Rasio fluoresensi Cy5 terhadap Cy3 pada setiap titik mencerminkan tingkat ekspresi relatif setiap gen antara kedua kondisi. Desain dua-warna mengontrol variasi titik-ke-titik tetapi memperkenalkan bias pewarna yang memerlukan eksperimen tukar-pewarna.

Array Saluran Tunggal

Array saluran tunggal seperti Affymetrix GeneChips menggunakan satu label fluoresen. Setiap sampel dihibridisasi ke array terpisah. Ekspresi gen diukur sebagai intensitas absolut, dan perbandingan dilakukan antar array setelah normalisasi. Array saluran tunggal memiliki throughput lebih tinggi untuk perbandingan berganda tetapi memerlukan metode normalisasi yang kuat untuk mengurangi variasi antar array. Array Affymetrix menggunakan beberapa probe per gen dengan probe pencocokan sempurna dan ketidakcocokan untuk membedakan hibridisasi spesifik dari latar belakang.

Normalisasi Data

Data microarray memerlukan prapemrosesan ekstensif. Koreksi latar belakang menghilangkan sinyal dari hibridisasi non-spesifik. Normalisasi menyesuaikan variasi teknis antar array. Normalisasi kuantil membuat distribusi intensitas probe identik di semua array, dengan asumsi sebagian besar gen tidak diekspresikan secara berbeda. Rata-rata robust multi-array menggabungkan koreksi latar belakang, normalisasi, dan perangkuman beberapa probe per gen.

Analisis Ekspresi Diferensial

Setelah normalisasi, uji statistik mengidentifikasi gen dengan perubahan ekspresi signifikan antar kondisi. Uji-t termoderasi, diimplementasikan dalam paket limma, meminjam informasi antar gen untuk menstabilkan estimasi varians. Koreksi pengujian berganda menggunakan metode Benjamini-Hochberg mengendalikan laju penemuan palsu. Hasil biasanya dilaporkan sebagai perubahan lipatan dengan nilai-p yang disesuaikan. Gen dengan perubahan lipatan di atas ambang dan nilai-p yang disesuaikan di bawah 0,05 dianggap diekspresikan secara diferensial.

Klastering dan Klasifikasi

Klastering tak terawasi mengelompokkan gen atau sampel berdasarkan kesamaan ekspresi tanpa pengetahuan sebelumnya. Klastering hierarkis menghasilkan dendrogram di mana gen dengan profil ekspresi serupa dikelompokkan bersama. Klastering K-means mempartisi gen ke dalam sejumlah klaster yang ditentukan. Pendekatan ini dapat mengungkapkan kelompok gen yang diregulasi bersama dan subtipe sampel baru.

Klasifikasi terawasi menggunakan label sampel yang diketahui untuk membangun prediktor yang dapat mengklasifikasikan sampel yang tidak diketahui. Mesin vektor dukungan, hutan acak, dan pengklasifikasi tetangga terdekat diterapkan. Tanda tangan ekspresi gen dapat mengklasifikasikan subtipe kanker, memprediksi prognosis, dan memandu pemilihan pengobatan. Tanda tangan PAM50 mengklasifikasikan kanker payudara ke dalam subtipe molekuler dengan prognosis berbeda.

Aplikasi

Microarray telah diterapkan di hampir setiap bidang biologi. Penelitian kanker menggunakan microarray untuk mengklasifikasikan tumor, mengidentifikasi tanda tangan prognostik, dan menemukan target obat. Uji kanker payudara MammaPrint dan Oncotype DX menggunakan tanda tangan ekspresi gen untuk memprediksi risiko kekambuhan. Biologi perkembangan mempelajari program transkripsi yang mendorong diferensiasi. Toksikologi menggunakan microarray untuk profil toksikogenomik. Microarray juga mendeteksi variasi jumlah salinan ketika digunakan untuk hibridisasi genomik komparatif.

Keterbatasan dan Transisi ke RNA-Seq

Microarray memiliki keterbatasan termasuk ketergantungan pada sekuens probe yang telah ditentukan, rentang dinamis terbatas, dan ketidakmampuan mendeteksi transkrip novel atau varian sambungan. Pengurutan RNA, aplikasi kunci dari pengurutan generasi berikutnya, telah menggantikan microarray untuk analisis ekspresi gen. RNA-seq menyediakan data hitungan digital dengan sensitivitas dan rentang dinamis yang lebih tinggi, mendeteksi transkrip dan isoform baru, dan tidak memerlukan probe yang telah ditentukan. Namun, microarray tetap berguna untuk organisme yang terk karakterisasi dengan baik dan aplikasi klinis di mana platform standar menguntungkan.