Hibridisasi in situ (ISH) adalah teknik yang menggunakan probe asam nukleat berlabel untuk mendeteksi sekuens DNA atau RNA spesifik langsung dalam irisan jaringan atau persiapan sitologi. Tidak seperti metode molekuler berbasis ekstraksi (PCR, sekuensing), ISH mempertahankan arsitektur jaringan dan menunjukkan dengan tepat sel mana yang mengandung sekuens target.
Prinsip
ISH menggunakan probe — molekul DNA atau RNA untai tunggal yang komplementer dengan sekuens target. Probe diberi label dengan penanda yang dapat dideteksi (isotop radioaktif, fluorofor, hapten). Setelah denaturasi DNA target (untuk DNA ISH) atau tanpa denaturasi (untuk RNA ISH), probe menghibridisasi ke sekuens target di bawah kondisi suhu dan garam yang terkontrol. Probe yang tidak terikat dicuci, dan probe yang terikat dideteksi dengan autoradiografi, mikroskop fluoresens, atau deteksi kromogenik berbasis enzim.
Stringensi — spesifisitas hibridisasi dikendalikan oleh suhu dan konsentrasi garam. Stringensi tinggi (suhu tinggi, garam rendah) hanya memungkinkan hibrida probe-target yang cocok sempurna untuk terbentuk. Stringensi lebih rendah memungkinkan ketidakcocokan parsial, yang mungkin diinginkan untuk mendeteksi sekuens terkait tetapi meningkatkan latar belakang.
Fluoresensi In Situ Hibridisasi (FISH)
FISH menggunakan probe berlabel fluorofor yang dideteksi dengan mikroskop fluoresens. Ini adalah metode ISH yang paling banyak digunakan dalam patologi diagnostik. Probe FISH meliputi: probe enumerasi sentromer (CEP) — menargetkan DNA satelit alfa spesifik kromosom di sentromer, digunakan untuk mendeteksi aneuploidi; probe indikator spesifik lokus (LSI) — menargetkan sekuens unik pada lokus kromosom spesifik, digunakan untuk mendeteksi amplifikasi gen (HER2, EGFR) dan delesi (1p/19q pada oligodendroglioma); probe break-apart — pasangan probe yang mengapit lokus gen; pemisahan mengindikasikan translokasi (ALK, ROS1, MYC, BCL2, BCL6, MALT1); probe fusi — satu probe di setiap sisi titik putus translokasi; sinyal fusi mengindikasikan translokasi.
HER2 FISH — standar emas untuk penentuan status HER2 pada kanker payudara dan lambung. Rasio sinyal HER2 (17q12) terhadap CEP17 >2,0 adalah teramplifikasi. FISH dilakukan ketika IHC equivocal (skor 2+).
ALK FISH — break-apart FISH untuk rearrangement ALK (2p23) pada adenokarsinoma paru mendeteksi pasien yang merespons inhibitor ALK (crizotinib, alectinib). IHC ALK (klon D5F3) sebagian besar telah menggantikan FISH sebagai tes skrining primer, tetapi FISH tetap menjadi metode konfirmasi.
Hibridisasi In Situ Kromogenik (CISH)
CISH menggunakan probe berlabel hapten yang dideteksi oleh reaksi kromogenik berbasis enzim (DAB untuk coklat, Fast Red untuk merah). Sinyal terlihat di bawah mikroskop medan terang, memungkinkan evaluasi simultan morfologi dan sinyal hibridisasi. CISH lebih murah daripada FISH (tidak memerlukan mikroskop fluoresens), menghasilkan kaca objek permanen, dan lebih mudah diakses di laboratorium histopatologi rutin.
Hibridisasi In Situ RNA
RNA ISH mendeteksi transkrip mRNA spesifik dalam irisan jaringan. RNAscope (Advanced Cell Diagnostics) adalah teknologi RNA ISH yang tersedia secara komersial menggunakan strategi desain probe (probe Z ganda) yang menghilangkan latar belakang dari pengikatan probe non-spesifik. Setiap mRNA target muncul sebagai sinyal seperti titik di sitoplasma (atau inti untuk transkrip baru). RNAscope hingga 100 kali lebih sensitif daripada RNA ISH tradisional dan dapat mendeteksi sedikitnya 1-2 salinan mRNA per sel.
Aplikasi RNA ISH meliputi: mendeteksi RNA virus (EBV EBER — metode standar untuk mengidentifikasi sel terinfeksi EBV pada limfoma Hodgkin, gangguan limfoproliferatif pasca-transplantasi, karsinoma nasofaring); HPV RNA (deteksi mRNA E6/E7 mengkonfirmasi infeksi HPV yang aktif secara transkripsi); analisis ekspresi gen (mRNA PD-L1, ekspresi sitokin dalam infiltrat inflamasi); penentuan lineage (mendeteksi transkrip spesifik jaringan pada tumor berdiferensiasi buruk).
Aplikasi Diagnostik
Diagnosis limfoma — FISH untuk translokasi MYC, BCL2, dan BCL6 pada limfoma sel B besar difus (limfoma double-hit dan triple-hit). EBER ISH untuk EBV pada limfoma Hodgkin dan gangguan limfoproliferatif pasca-transplantasi.
Diagnosis sarkoma — FISH untuk SS18 (sarkoma sinovial), FKHR (rabdomiosarkoma alveolar), EWSR1 (sarkoma Ewing, tumor sel bulat kecil desmoplastik), dan MDM2 (liposarkoma berdiferensiasi baik/dediferensiasi).
Kanker paru — ALK FISH, ROS1 FISH, dan MET amplifikasi FISH untuk pemilihan terapi tertarget.
Kanker payudara — HER2 FISH untuk kasus IHC equivocal.
Keterbatasan
FISH memerlukan mikroskop fluoresens dan perangkat lunak khusus untuk enumerasi sinyal. Penetrasi probe dalam irisan jaringan tebal mungkin tidak lengkap. Pemudaran sinyal — fluorofor mengalami photobleaching dengan eksitasi berkepanjangan; kaca objek harus disimpan dalam gelap. Tantangan interpretasi meliputi inti terpotong (artefak pemotongan pada irisan parafin dapat menghilangkan sinyal — gunakan irisan 4 µm), sinyal tumpang tindih, dan polisomi. Degradasi RNA pada jaringan yang diawetkan dengan buruk menyebabkan RNA ISH negatif palsu. Jaminan mutu mencakup validasi rutin dengan kontrol positif dan negatif yang diketahui, partisipasi dalam program EQA, dan kriteria interpretasi yang terdokumentasi.
