Northern Blotting adalah teknik laboratorium yang digunakan untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi molekul RNA tertentu dalam sampel biologis. Sementara Western blot melihat protein dan Southern blot melihat DNA, Northern blot memberi tahu ilmuwan gen mana yang sebenarnya “diaktifkan” (diekspresikan) dalam sel pada waktu tertentu. Dengan mengukur jumlah RNA messenger (mRNA), peneliti dapat menentukan apakah suatu penyakit, obat, atau perubahan lingkungan menyebabkan sel meningkatkan atau menurunkan produksi instruksi spesifik.
Cara Kerja Northern Blotting
RNA terkenal rapuh dan rentan terdegradasi oleh enzim yang disebut RNase yang ada di mana-mana — bahkan di ujung jari Anda. Karena itu, prosesnya membutuhkan perawatan ekstrem dan kondisi “bersih”.
- Pemisahan RNA
Total RNA diekstraksi dari sel dan dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan elektroforesis gel. Karena RNA adalah untai tunggal, ia cenderung terlipat menjadi bentuk kompleks; untuk mencegah hal ini, agen “denaturasi” (seperti formaldehida) ditambahkan ke gel untuk menjaga molekul RNA tetap linier sehingga mereka bergerak secara ketat sesuai dengan panjangnya.
- Transfer
Seperti dalam Western blot, untai RNA yang terpisah dipindahkan dari gel yang rapuh ke membran nilon atau nitroselulosa yang kuat. Ini sering dilakukan melalui aksi kapiler, di mana tumpukan handuk kertas “menyerap” buffer SSC (saline-sodium citrate) melalui gel dan membran, menarik RNA bersamanya dan menjebaknya di permukaan membran.
- Hibridisasi
Membran diekspos ke probe — potongan pendek DNA atau RNA untai tunggal yang komplementer dengan sekuens target. Probe ini “diberi label” dengan atom radioaktif atau pewarna fluoresen. Probe memindai membran dan mengikat (berhibridisasi) hanya dengan pasangan RNA yang cocok, mengabaikan semua “kebisingan” RNA lainnya.
- Deteksi
Setelah mencuci probe yang tidak terikat, membran ditempatkan melawan film sinar-X atau dipindai dengan pencitra digital. Probe yang diberi label menciptakan pita gelap atau garis bercahaya. Ketebalan dan intensitas pita memberi tahu ilmuwan persis berapa banyak mRNA spesifik yang ada dalam sampel asli.
