Gambaran Umum
Sekuensing RNA (RNA-seq) telah menjadi metode standar untuk mengukur ekspresi gen, menggantikan pendekatan berbasis hibridisasi sebelumnya. Dengan mengubah molekul RNA menjadi perpustakaan cDNA dan menyekuensing jutaan fragmen, RNA-seq menyediakan identitas dan kelimpahan transkrip dalam sampel biologis. Tidak seperti mikroarray, RNA-seq dapat mendeteksi transkrip baru, varian sambungan, dan RNA non-koding tanpa desain probe sebelumnya. Teknik ini memberikan rentang dinamis yang mencakup beberapa orde magnitudo dan resolusi satu basa. Data RNA-seq mendasari sebagian besar studi transkriptomika modern, dari organisme model hingga spesimen klinis.
Konsep Kunci
Pipeline analisis RNA-seq dimulai dengan bacaan sekuensing mentah, yang menjalani kontrol kualitas (FastQC), pemotongan adapter (Trimmomatic atau Cutadapt), dan penyejajaran ke genom referensi menggunakan aligner sadar-sambungan seperti STAR atau HISAT2. Kuantifikasi pada tingkat gen atau transkrip dilakukan oleh alat seperti featureCounts, RSEM, atau Salmon. Nilai ekspresi dinormalisasi sebagai FPKM, RPKM, atau TPM untuk memperhitungkan kedalaman sekuensing dan panjang transkrip. Deteksi alternative splicing dan transkrip baru memerlukan alat khusus seperti Cufflinks atau StringTie, yang merakit transkrip dari bacaan yang disejajarkan. Metrik kualitas meliputi tingkat pemetaan, distribusi bacaan di seluruh fitur gen, dan analisis saturasi.
Aplikasi
RNA-seq diterapkan di hampir semua bidang biologi. Ini memprofilkan perubahan ekspresi gen pada penyakit versus jaringan sehat, mengidentifikasi biomarker untuk subtipe kanker, dan melacak program ekspresi gen perkembangan. Dalam mikrobiologi, RNA-seq mengungkap respons transkripsi terhadap antibiotik dan stres lingkungan. Teknik ini dibangun langsung di atas metode RNA sequencing dan sering diintegrasikan dengan alur kerja next-generation sequencing. RNA-seq juga memungkinkan penemuan RNA structures and types baru, termasuk RNA non-koding panjang dan RNA sirkuler, memperluas pemahaman kita tentang kompleksitas transkriptom.
