Gambaran Umum
Proteomika top-down menganalisis protein utuh dengan spektrometri massa tanpa pencernaan enzimatik sebelumnya. Tidak seperti pendekatan bottom-up konvensional yang menyimpulkan identitas protein dari peptida, proteomika top-down mengukur massa utuh protein dan kemudian memfragmentasinya di dalam spektrometer massa untuk memperoleh informasi sekuens. Pendekatan ini mempertahankan konteks protein lengkap, yang berarti bahwa kombinasi modifikasi pasca-translasi, varian sekuens, dan bentuk sambungan alternatif — yang secara kolektif disebut proteoform — diamati sebagai spesies molekul yang berbeda. Proteomika top-down oleh karena itu memberikan pandangan langsung dan tidak ambigu tentang lanskap proteoform yang sebagian besar tidak terlihat oleh metode bottom-up.
Metode
Ion protein utuh dimasukkan ke dalam spektrometer massa melalui ionisasi electrospray, yang menghasilkan selubung status muatan dari mana massa molekul dihitung. Fragmentasi dicapai menggunakan teknik seperti electron capture dissociation (ECD) atau electron transfer dissociation (ETD), yang secara preferensial memotong tulang punggung protein sambil mempertahankan modifikasi labil seperti fosforilasi dan glikosilasi. Identifikasi proteoform bergantung pada algoritma yang mencocokkan massa utuh yang diukur dan ion fragmen terhadap basis data proteoform yang diprediksi. Spektrometer massa resolusi ultra-tinggi seperti Fourier-transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) dan Orbitrap sangat penting untuk menyelesaikan perbedaan massa kecil antara proteoform yang terkait.
Aplikasi
Proteomika top-down unggul dalam mengkarakterisasi post-translational modifications dan pola kombinatorialnya pada protein individu. Ini digunakan untuk mempelajari kode modifikasi histon, heterogenitas antibodi, dan produk degradasi protein. Pendekatan ini melengkapi proteomics and mass spectrometry bottom-up dan mendapat manfaat dari instrumentasi mass spectrometry yang sama, sambil memberikan wawasan unik tentang biologi proteoform yang penting untuk memahami mekanisme penyakit dan mengembangkan terapi presisi.
