Visão Geral
A proteômica direcionada foca na quantificação de um conjunto predefinido de proteínas com alta sensibilidade, especificidade e rendimento, ao contrário da proteômica de descoberta que visa cobertura ampla e não direcionada. A técnica mais amplamente adotada é o monitoramento de reação selecionada (SRM, também chamado de monitoramento de reação múltipla ou MRM) realizado em espectrômetros de massas triplo quadrupolo. Os ensaios de SRM visam transições específicas de precursor-peptídeo-para-fragmento, conhecidas como peptídeos proteotípicos, que representam unicamente a proteína de interesse. Esta abordagem oferece precisão quantitativa comparável a imunoensaios, enquanto oferece maior capacidade de multiplexação e desenvolvimento de ensaio mais rápido.
Métodos
O desenvolvimento do ensaio começa com a seleção de peptídeos proteotípicos — peptídeos que são únicos para a proteína alvo, bem comportados no espectrômetro de massas e produzem íons fragmento intensos. Para cada peptídeo, várias transições (m/z do íon precursor para m/z do íon fragmento) são monitoradas durante o período de eluição cromatográfica. Padrões internos, tipicamente versões marcadas com isótopos estáveis dos peptídeos alvo, são adicionados à amostra em concentrações conhecidas para permitir quantificação absoluta. O monitoramento de reação paralela (PRM) em instrumentos Orbitrap oferece uma abordagem relacionada com aquisição de espectro completo de alta resolução. Métodos de aquisição independente de dados (DIA), como SWATH-MS, preenchem a lacuna entre a análise de descoberta e a direcionada, registrando todos os íons fragmento de todos os precursores de forma sistemática.
Aplicações
A proteômica direcionada é o método de escolha para verificar e validar biomarcadores candidatos descobertos em estudos não direcionados. É extensivamente usada em pesquisa clínica para quantificar painéis de proteínas ligadas a doenças específicas. Os ensaios complementam medições tradicionais de ELISA, oferecem uma alternativa a abordagens baseadas em gel e podem ser multiplexados para rastrear dezenas de proteínas em uma única corrida. A integração com separação por HPLC e detecção por espectrometria de massas garante quantificação robusta, enquanto ensaios de quantificação de proteínas fornecem validação ortogonal da concentração total de proteínas.
