免疫组织化学（IHC）是一种使用与可检测标记物偶联的抗体在组织切片中可视化特定抗原的技术。它桥梁了形态学和分子身份，使病理学家不仅能看到细胞的样子，还能看到它们表达哪些蛋白质。IHC在诊断病理学中已变得不可或缺，特别是用于肿瘤分类和预测性生物标志物检测。

抗体类型

多克隆抗体通过用靶抗原免疫动物（兔、山羊）产生；所得血清含有识别不同表位的抗体混合物。它们灵敏度高但特异性较低，且批次间存在差异。

单克隆抗体由单个B细胞克隆与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤而产生。它们识别单个表位，提供高特异性和可重复的性能。小鼠单克隆抗体历史上是标准，但现在兔单克隆抗体占主导地位，因为它们由于更高的亲和力和与更多样化表位的结合而提供更好的灵敏度。

重组抗体从测序的抗体基因工程化而来，消除了动物免疫。它们提供无与伦比的一致性，并可为特定格式（Fab片段、单链变体、双特异性抗体）设计。

检测系统

直接IHC使用直接与标记物（酶或荧光团）偶联的一抗。它简单快速，但灵敏度低，因为每个抗原只有一个标记抗体结合。

间接IHC使用未标记的一抗，通过标记的二抗检测，该二抗靶向一抗的物种特异性Fc区。每个一抗有多个二抗结合产生的放大效应提高了灵敏度。

聚合物基检测使用与多个二抗和多个酶分子偶联的聚合物骨架（葡聚糖或类似物）。这提供了强信号放大，而没有亲和素-生物素系统的背景问题。

亲和素-生物素复合物（ABC）法利用亲和素（或链霉亲和素）对生物素的高亲和力。生物素化的二抗通过预形成的亲和素和生物素化酶复合物检测。虽然灵敏，但组织中的内源性生物素（肝、肾、脑）可引起背景染色。

色原和荧光团

**DAB（3,3’-二氨基联苯胺）**在靶抗原位点产生棕色不溶性沉淀。它耐酒精且永久，使其成为明视野IHC中使用最广泛的色原。

Fast Red和AEC产生红色沉淀，可溶于酒精，需要水性封片剂。它们在与DAB联合用于双染IHC时很有用。

荧光团（FITC、TRITC、Alexa染料）通过光谱分离实现多标记免疫荧光，允许同时可视化多种抗原。

抗原修复

福尔马林固定产生亚甲基桥交联，掩盖了许多表位，使其无法被抗体访问。**热诱导表位修复（HIER）**使用微波炉、压力锅或水浴将切片在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）或Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）中加热20-40分钟，断裂交联并恢复抗原性。酶修复使用蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）处理对热敏感的抗原。修复方法的选择是抗体特异性的，并在IHC验证期间进行优化。

对照与解读

每次IHC运行必须包括阳性对照（已知以预期强度和定位——核、胞质或膜——表达靶抗原的组织）和阴性对照（相同组织在不加一抗的情况下处理）。内部阳性对照（同一切片中应表达该抗原的非肿瘤细胞）提供额外的验证。染色解读为阳性或阴性，注意亚细胞定位——预期显示核染色（ER、Ki-67）的抗体如果显示胞质染色，则很可能是非特异性的。