重组DNA技术将不同来源的DNA分子结合起来，创造出自然不会发生的新基因组合。它是现代分子生物学的基础，使治疗性蛋白质、转基因生物的生产和整个基因组的测序成为可能。

限制性内切酶

限制性核酸内切酶 是在特定识别序列（长度通常为 4 到 8 个碱基对）处切割 DNA 的细菌酶。 II 型限制酶识别回文序列并在识别位点内切割，产生平末端或交错切割，从而产生具有短单链突出端的粘性末端。 EcoRI 识别 GAATTC 并产生带有 AATT 突出端的粘性末端，而 SmaI 识别 CCCGGG 并产生平端。限制酶的特异性允许生成和组合指定的 DNA 片段，而 PCR 提供了另一种扩增特定 DNA 序列的方法。

DNA 连接酶

[DNA 连接酶](/guides/dna-ligation-and-cloning.html) 通过催化 3 素羟基和 5 素磷酸之间形成磷酸二酯键来密封 DNA 主链中的切口。 T4 DNA 连接酶是最常用的克隆酶，可以连接粘性末端和平端。粘端连接非常有效，因为互补的突出端能够正确对齐片段。平端连接效率较低，但不需要兼容的突出端。该酶使用 ATP 作为能量来源，形成 AMP 酶中间体，激活 5 素磷酸。

克隆载体

质粒 是小的环状 DNA 分子，可以独立于细菌染色体进行复制。它们是最常见的 DNA 克隆载体，携带复制起点、抗生素抗性基因等选择性标记以及包含独特限制性位点的多克隆位点。 pUC 系列质粒使用 lacZ 基因进行蓝白斑筛选，其中 lacZ 的插入失活可以通过 X-gal 平板上的白色将重组体与非重组体区分开来。

细菌人工染色体基于大肠杆菌 F 因子，可携带长达 300 KB 的插入片段。酵母人工染色体包含用于在酵母中繁殖的着丝粒、端粒和复制序列，并且可以携带超过一兆碱基的插入片段。这些大插入载体对于基因组作图和测序项目至关重要。

表达载体

表达载体含有驱动宿主生物体中克隆基因转录和翻译的调控序列。细菌表达载体使用强启动子，例如 T7 或 tac 启动子，通常具有用于控制表达的诱导系统。 lac 操作员允许用 IPTG 进行诱导，T7 系统在 lac 控制下使用 T7 RNA 聚合酶。通常添加 6xHis、GST 或 MBP 等融合标签以促进纯化和检测离子。

真核表达载体使用来自巨细胞病毒或猿猴病毒 40 的启动子，以在哺乳动物细胞中强表达。它们包括用于正确 mRNA 加工的聚腺苷酸化信号，通常还包括用于稳定细胞系生成的选择性标记，例如新霉素抗性。当需要有效递送和整合时，可以使用源自 AAV、慢病毒或逆转录病毒的病毒载体。

宿主生物

大肠杆菌是 DNA 克隆最常见的宿主，具有快速生长、高转化效率和良好的遗传学特征。专用菌株可用于特定目的：用于克隆的 DH5-alpha、用于蛋白质表达的 BL21 以及用于生成含尿嘧啶模板的 CJ236。酵母，特别是酿酒酵母，用于克隆大 DNA 片段和表达需要翻译后修饰的真核蛋白。

HEK293 和 CHO 细胞等哺乳动物细胞系用于生产具有与人类相容的糖基化模式的治疗性蛋白质。用杆状病毒载体感染的昆虫细胞通过真核处理提供高蛋白质产量。使用大肠杆菌、小麦胚芽或兔网织红细胞提取物的无细胞系统可以在没有活细胞的情况下快速生产蛋白质。

应用程序

重组DNA技术已经产生了许多治疗性蛋白质。人胰岛素是第一个重组治疗药物，由 Genentech 在大肠杆菌中生产，并于 1982 年获得批准。其他重组蛋白包括生长激素、促红细胞生成素、血友病因子 VIII 和单克隆抗体。该技术能够在不依赖动物来源的情况下大量生产人类蛋白质。

转基因生物是通过将重组 DNA 引入植物、动物或微生物而产生的。 Bt 作物表达来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白。重组微生物生产工业酶、生物燃料和生物化学品。该技术还用于基因功能分析、创建基因敲除和转基因生物以及生产疫苗，例如酵母中产生的乙型肝炎表面抗原。