重组DNA技术将来自不同来源的DNA分子组合以创建自然界中不存在的新的遗传组合。它是现代分子生物学的基础，使得治疗性蛋白质的生产、转基因生物的创建和整个基因组的测序成为可能。

限制性内切酶

限制性核酸内切酶是细菌酶，在特定的识别序列（通常4至8碱基对长度）切割DNA。II型限制性内切酶识别回文序列并在识别位点内切割，产生平末端或产生具有短单链突出端的粘性末端。EcoRI识别GAATTC并产生具有AATT突出端的粘性末端，而SmaI识别CCCGGG并产生平末端。限制性内切酶的特异性允许生成和组合确定的DNA片段，而PCR提供了扩增特定DNA序列的替代方法。

DNA连接酶

DNA连接酶通过催化3’羟基和5’磷酸之间形成磷酸二酯键来密封DNA骨架中的切口。T4 DNA连接酶是克隆中最常用的酶，可以连接粘性和平末端。粘性末端连接高效，因为互补突出端正确对齐片段。平末端连接效率较低但不需要相容的突出端。该酶使用ATP作为能量来源，形成激活5’磷酸的AMP-酶中间体。

克隆载体

质粒是独立于细菌染色体复制的小型环状DNA分子。它们是DNA克隆中最常见的载体，携带复制起点、选择标记如抗生素抗性基因以及含有独特限制性位点的多克隆位点。pUC系列质粒使用lacZ基因进行蓝白筛选，其中lacZ的插入失活允许通过在X-gal板上呈现白色来区分重组子和非重组子。

细菌人工染色体基于大肠杆菌F因子，可携带高达300千碱基的插入片段。酵母人工染色体含有用于在酵母中繁殖的着丝粒、端粒和复制序列，可携带超过一兆碱基的插入片段。这些大插入载体对基因组作图和测序项目至关重要。

表达载体

表达载体含有驱动克隆基因在宿主生物中转录和翻译的调控序列。细菌表达载体使用强启动子如T7或tac启动子，通常带有用于受控表达的诱导系统。lac操纵子允许用IPTG诱导，T7系统使用受lac控制的T7 RNA聚合酶。融合标签如6xHis、GST或MBP通常添加以方便纯化和检测。

真核表达载体使用巨细胞病毒或猿猴病毒40的启动子在哺乳动物细胞中实现强表达。它们包含用于正确mRNA加工的多聚腺苷酸化信号，以及通常用于稳定细胞系生成的选择标记如新霉素抗性。来自AAV、慢病毒或逆转录病毒的病毒载体在需要高效递送和整合时使用。

宿主生物

大肠杆菌是DNA克隆中最常见的宿主，提供快速生长、高转化效率和特征明确的遗传学。专门的菌株可用于特定目的：DH5-α用于克隆，BL21用于蛋白质表达，CJ236用于生成含尿嘧啶的模板。酵母（特别是酿酒酵母）用于克隆大型DNA片段和表达需要翻译后修饰的真核蛋白。

哺乳动物细胞系如HEK293和CHO细胞用于生产具有与人类相容的糖基化模式的治疗性蛋白质。用杆状病毒载体感染的昆虫细胞提供具有真核加工的高蛋白质产量。使用大肠杆菌、麦胚或兔网织红细胞提取物的无细胞系统允许在无活细胞的情况下快速生产蛋白质。

应用

重组DNA技术已生产了许多治疗性蛋白质。人胰岛素是第一个重组治疗药物，由Genentech在大肠杆菌中生产并于1982年获批。其他重组蛋白包括生长激素、促红细胞生成素、用于血友病的因子VIII和单克隆抗体。该技术能够大量生产人源蛋白质而无需依赖动物来源。

转基因生物通过将重组DNA引入植物、动物或微生物中创建。Bt作物表达来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白。重组微生物生产工业酶、生物燃料和生化产品。该技术还用于基因功能分析、创建敲除和转基因生物，以及生产疫苗如酵母中产生的乙型肝炎表面抗原。