Die CRISPR-Technologie hat sich weit über die Genomeditierung mit Cas9 hinaus entwickelt und umfasst Basen-Editierung, Prime-Editierung, Genregulation und diagnostische Anwendungen. Diese Fortschritte haben die Molekularbiologie, Biotechnologie und Medizin transformiert.

Über Cas9 hinaus: Der CRISPR-Werkzeugkasten

CRISPR-Cas-Systeme sind adaptive Immunsysteme in Bakterien und Archaeen, und ihre Komponenten wurden für verschiedene Anwendungen angepasst. Cas9 aus Streptococcus pyogenes war das erste weit verbreitete Editierenzym, das durch eine einzelne Führungs-RNA gesteuerte Doppelstrangbrüche erzeugt. Cas12a, früher Cpf1 genannt, erzeugt versetzte Schnitte und prozessiert seine eigene Prä-crRNA, was Multiplexing vereinfacht. Cas13 zielt auf RNA statt DNA ab und hat kollaterale Spaltaktivität. Cas14 zielt auf einzelsträngige DNA ab.

CRISPR-Interferenz

Katalytisch tote Cas9, die Mutationen in beiden Nukleasedomänen aufweist, behält die DNA-Bindung bei, kann aber nicht schneiden. Die Fusion von dCas9 mit Repressordomänen wie KRAB erzeugt CRISPRi, das die Genexpression durch Blockierung der Transkriptionsinitiation oder -verlängerung stilllegt. Im Gegensatz zur RNA-Interferenz wirkt CRISPRi auf DNA-Ebene und erzeugt eine vollständigere und spezifischere Repression.

CRISPRi ist hoch spezifisch mit minimalen Off-Target-Effekten. Es kann in bakteriellen und Säugetierzellen verwendet werden und ist reversibel, wenn die dCas9-Expression ausgeschaltet wird. Die gezielte Ansteuerung des Promotors oder der ersten paar hundert Basenpaare der kodierenden Sequenz erzeugt die stärkste Repression. Multiplex-CRISPRi mit mehreren Führungs-RNAs kann gleichzeitig mehrere Gene reprimieren.

CRISPR-Aktivierung

dCas9, fusioniert mit Aktivatordomänen wie VP64 oder VPR, erzeugt CRISPRa, das die endogene Genexpression aktiviert. Die stärkste Aktivierung verwendet das synergistische Aktivierungsmediator-System, bei dem mehrere Aktivatordomänen durch Antikörper-Epitop-Interaktionen an den Zielpromotor rekrutiert werden. CRISPRa aktiviert die Genexpression aus dem natürlichen genomischen Kontext und bewahrt Spleißen und regulatorische Elemente.

CRISPRa kann Gene aktivieren, die in einem Zelltyp ansonsten still sind, und ermöglicht funktionelle Studien von Genen ohne Klonierung von cDNAs. Es wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die Arzneimittelresistenzen verleihen, die Zellidentität umzuprogrammieren und nach Genen zu screenen, die an spezifischen biologischen Prozessen beteiligt sind. CRISPRa-Screens verwenden Führungs-RNA-Bibliotheken, die auf alle bekannten Promotoren abzielen.

Basen-Editierung

Die Basen-Editierung wandelt eine DNA-Base direkt in eine andere um, ohne einen Doppelstrangbruch zu erzeugen. Cytosin-Basen-Editoren fusionieren eine Cytidin-Desaminase mit einer Cas9-Nickase und wandeln C in T innerhalb eines 5-Nukleotid-Editierfensters um. Adenin-Basen-Editoren wandeln A in G unter Verwendung einer manipulierten Desaminase um. Die Nickase erzeugt einen Einzelstrangbruch auf dem nicht editierten Strang und fördert die Reparatur unter Verwendung des editierten Strangs als Matrize.

Die Basen-Editierung ist hoch effizient und erzeugt weniger unerwünschte Ergebnisse als die Cas9-Editierung. Sie kann keine beliebigen Editierungen einführen, aber etwa 60 % der krankheitsassoziierten Punktmutationen korrigieren. BE4 und ABE7.10 sind optimierte Basen-Editoren mit verbesserter Effizienz und reduzierten Off-Target-Effekten. Die Basen-Editierung wurde in Modellorganismen, Pflanzen und in der präklinischen Gentherapie angewendet.

Prime-Editierung

Die Prime-Editierung verwendet eine Cas9-Nickase, die mit einer reversen Transkriptase fusioniert ist, zusammen mit einer Prime-Editierungs-Guide-RNA, die sowohl die Zielstelle spezifiziert als auch die gewünschte Editierung kodiert. Die pegRNA enthält eine Primer-Bindungsstelle und eine Reverse-Transkriptions-Matrize, die die Editierung enthält. Nach dem Nicken des Zielstrangs wird die RT-Matrize verwendet, um editierte DNA zu synthetisieren. Zelluläre Reparaturwege integrieren die editierte Sequenz.

Die Prime-Editierung kann alle möglichen Einzelnukleotid-Substitutionen sowie kleine Insertionen und Deletionen einführen, ohne dass ein Doppelstrangbruch oder eine Donor-Matrize erforderlich ist. Off-Target-Effekte sind geringer als bei Cas9 oder Basen-Editoren. Die Prime-Editierungseffizienz variiert je nach Zielstelle und Zelltyp, und laufende Optimierungen zielen darauf ab, den Transfer und die Aktivität zu verbessern.

CRISPR-Diagnostik

Cas12 und Cas13 haben kollaterale Spaltaktivität: Nach Erkennung ihrer Zielnukleinsäure spalten sie unspezifisch nahegelegene einzelsträngige DNA oder RNA. Diese Eigenschaft wurde für die Molekulardiagnostik genutzt. DETECTR verwendet Cas12a und SHERLOCK verwendet Cas13, um spezifische Nukleinsäuresequenzen zu detektieren.

Wenn die Zielsequenz vorhanden ist, erzeugt die kollaterale Spaltung eines Reportermoleküls ein fluoreszierendes oder kolorimetrisches Signal. Diese Systeme erreichen attomolare Empfindlichkeit und können Einzelnukleotid-Varianten unterscheiden. CRISPR-Diagnostika wurden für den Virusnachweis einschließlich SARS-CoV-2, Zika und Dengue entwickelt, mit Ergebnissen in unter einer Stunde ohne komplexe Ausrüstung.

CRISPR-Screening

CRISPR-Bibliotheken, die auf tausende Gene abzielen, ermöglichen genomweite funktionelle Screens. Führungs-RNA-Bibliotheken werden in einen Zellpool eingebracht, und die Wirkung jedes Knockouts wird durch Anreicherung oder Verarmung der Führungs-RNA mittels PCR gemessen. Positive-Selektions-Screens identifizieren Gene, deren Knockout einen Wachstumsvorteil verleiht. Negative-Selektions-Screens identifizieren Gene, die für das Zellüberleben essentiell sind. CRISPR-Screens haben eine höhere Empfindlichkeit und ein geringeres Rauschen als RNAi-Screens.