La technologie CRISPR s’est étendue bien au-delà de l’édition génomique avec Cas9 pour inclure l’édition de bases, l’édition primitive, la régulation génique et les applications diagnostiques. Ces avancées ont transformé la biologie moléculaire, la biotechnologie et la médecine.

Au-delà de Cas9 : la boîte à outils CRISPR

Les systèmes CRISPR-Cas sont des systèmes immunitaires adaptatifs chez les bactéries et les archées, et leurs composants ont été adaptés pour diverses applications. Cas9 de Streptococcus pyogenes a été la première enzyme d’édition largement utilisée, créant des cassures double brin guidées par un ARN guide unique. Cas12a, anciennement appelé Cpf1, crée des coupures décalées et traite son propre pré-ARNcr, simplifiant le multiplexage. Cas13 cible l’ARN plutôt que l’ADN et a une activité de clivage collatéral. Cas14 cible l’ADN simple brin.

Interférence CRISPR

La Cas9 catalytiquement morte, qui a des mutations dans les deux domaines nucléase, conserve la liaison à l’ADN mais ne peut pas couper. La fusion de dCas9 à des domaines répresseurs tels que KRAB crée CRISPRi, qui réprime l’expression génique en bloquant l’initiation ou l’élongation de la transcription. Contrairement à l’interférence ARN, CRISPRi fonctionne au niveau de l’ADN, produisant une répression plus complète et plus spécifique.

CRISPRi est hautement spécifique avec des effets hors cible minimaux. Il peut être utilisé dans les cellules bactériennes et mammifères et est réversible lorsque l’expression de dCas9 est désactivée. Le ciblage du promoteur ou des premières centaines de paires de bases de la séquence codante produit la répression la plus forte. Le CRISPRi multiplexé avec plusieurs ARN guides peut réprimer simultanément plusieurs gènes.

Activation CRISPR

La dCas9 fusionnée à des domaines activateurs tels que VP64 ou VPR crée CRISPRa, qui active l’expression génique endogène. L’activation la plus forte utilise le système SAM, où plusieurs domaines activateurs sont recrutés au promoteur cible par des interactions anticorps-épitope. CRISPRa active l’expression génique à partir du contexte génomique naturel, préservant l’épissage et les éléments régulateurs.

CRISPRa peut activer des gènes qui sont autrement silencieux dans un type cellulaire, permettant des études fonctionnelles de gènes sans clonage d’ADNc. Il a été utilisé pour identifier les gènes qui confèrent une résistance aux médicaments, reprogrammer l’identité cellulaire et cribler les gènes impliqués dans des processus biologiques spécifiques. Les criblages CRISPRa utilisent des bibliothèques d’ARN guide ciblant tous les promoteurs connus.

Édition de bases

L’édition de bases convertit directement une base d’ADN en une autre sans créer de cassure double brin. Les éditeurs de bases cytosine fusionnent une cytidine désaminase à une Cas9 nickase, convertissant C en T dans une fenêtre d’édition de 5 nucléotides. Les éditeurs de bases adénine convertissent A en G en utilisant une désaminase modifiée. La nickase crée une entaille simple brin sur le brin non édité, favorisant la réparation en utilisant le brin édité comme matrice.

L’édition de bases est très efficace et produit moins de résultats indésirables que l’édition par Cas9. Elle ne peut pas introduire des modifications arbitraires mais peut corriger environ 60 % des mutations ponctuelles associées aux maladies. BE4 et ABE7.10 sont des éditeurs de bases optimisés avec une efficacité améliorée et une réduction des modifications hors cible. L’édition de bases a été appliquée dans des organismes modèles, des plantes et la thérapie génique préclinique.

Édition primitive

L’édition primitive utilise une Cas9 nickase fusionnée à une transcriptase inverse, avec un ARN guide d’édition primitive qui spécifie à la fois le site cible et code la modification souhaitée. L’ARNpeg comprend un site de liaison d’amorce et un modèle de transcription inverse contenant la modification. Après l’entaille du brin cible, le modèle de RT est utilisé pour synthétiser l’ADN édité. Les voies de réparation cellulaire incorporent la séquence éditée.

L’édition primitive peut installer toutes les substitutions de nucléotides uniques possibles, ainsi que de petites insertions et délétions, sans nécessiter de cassure double brin ni de matrice donneuse. L’édition hors cible est plus faible qu’avec Cas9 ou les éditeurs de bases. Les efficacités d’édition primitive varient selon le site cible et le type cellulaire, et l’optimisation en cours vise à améliorer la délivrance et l’activité.

Diagnostics CRISPR

Cas12 et Cas13 ont une activité de clivage collatéral : après reconnaissance de leur acide nucléique cible, ils clivent de manière non spécifique l’ADN ou l’ARN simple brin voisin. Cette propriété a été exploitée pour le diagnostic moléculaire. DETECTR utilise Cas12a et SHERLOCK utilise Cas13 pour détecter des séquences d’acides nucléiques spécifiques.

Lorsque la séquence cible est présente, le clivage collatéral d’une molécule rapporteuse génère un signal fluorescent ou colorimétrique. Ces systèmes atteignent une sensibilité attomolaire et peuvent distinguer des variants nucléotidiques uniques. Les diagnostics CRISPR ont été développés pour la détection virale, notamment le SARS-CoV-2, le Zika et la dengue, avec des résultats lus en moins d’une heure sans équipement complexe.

Criblage CRISPR

Les bibliothèques CRISPR ciblant des milliers de gènes permettent des criblages fonctionnels à l’échelle du génome. Les bibliothèques d’ARN guide sont délivrées à un pool de cellules, et l’effet de chaque knockout est mesuré par l’enrichissement ou la déplétion de l’ARN guide en utilisant la PCR. Les criblages par sélection positive identifient les gènes dont l’inactivation confère un avantage de croissance. Les criblages par sélection négative identifient les gènes essentiels à la survie cellulaire. Les criblages CRISPR ont une sensibilité plus élevée et un bruit plus faible que les criblages par ARNi.