Imunopresipitasi kromatin adalah metode untuk memetakan interaksi protein-DNA dalam genom. Ini mengidentifikasi situs pengikatan genom dari faktor transkripsi, histon dengan modifikasi spesifik, dan protein terkait kromatin lainnya, memberikan wawasan tentang regulasi gen dan struktur kromatin.

Prinsip Dasar

ChIP dimulai dengan pengikatan silang protein ke DNA dalam sel hidup, biasanya menggunakan formaldehida yang membuat ikatan silang kovalen antara protein dan DNA dalam beberapa angstrom. Kromatin yang terikat silang dipecah menjadi fragmen 200 hingga 600 pasangan basa oleh sonikasi atau digesti enzimatik. Antibodi spesifik terhadap protein yang diminati digunakan untuk mengimunopresipitasi kompleks protein-DNA. Ikatan silang dibalik, dan DNA dimurnikan. Fragmen DNA yang diperkaya kemudian diidentifikasi oleh PCR kuantitatif, microarray, atau pengurutan.

Pengikatan Silang

Pengikatan silang formaldehida adalah metode standar, membuat jembatan metilen antara gugus amino yang berinteraksi dekat. Ini reversibel oleh panas dan efektif untuk protein yang langsung kontak dengan DNA. Untuk protein yang mengikat DNA secara tidak langsung atau lemah, pengikat silang alternatif seperti etilen glikol bis-suksinimidi suksinat dapat digunakan. ChIP asli menghilangkan pengikatan silang dan bekerja untuk protein yang terikat erat seperti histon.

Pemecahan Kromatin

Sonikasi menghasilkan fragmen DNA acak dengan pemecahan mekanis. Distribusi ukuran fragmen sangat penting, karena fragmen yang lebih kecil memberikan resolusi situs pengikatan yang lebih tinggi. Kondisi sonikasi harus dioptimalkan untuk setiap tipe sel untuk menghindari pemecahan berlebihan atau kurang. Digesti enzimatik menggunakan nuklease mikrokokus adalah alternatif untuk ChIP asli, membelah DNA di antara nukleosom.

Imunopresipitasi

Keberhasilan ChIP bergantung pada kualitas antibodi. Antibodi harus mengenali targetnya dalam kromatin terikat silang dengan spesifisitas dan afinitas tinggi. Antibodi kelas ChIP divalidasi untuk aplikasi ini. Protein A atau protein G agarosa atau manik magnetik digunakan untuk menangkap kompleks antibodi-kromatin. Manik magnetik lebih disukai untuk latar belakang lebih rendah dan pemrosesan lebih cepat.

ChIP-qPCR

Untuk gen target yang diketahui, ChIP-qPCR ( PCR kuantitatif) mengkuantifikasi pengayaan di daerah genomik spesifik. Primer dirancang untuk situs pengikatan yang diduga dan untuk daerah kontrol negatif. Pengayaan dihitung sebagai peningkatan lipatan atas kontrol negatif atau kromatin masukan. ChIP-qPCR sensitif, kuantitatif, dan cocok untuk studi berbasis hipotesis dari lokus terpilih.

ChIP-on-Chip

ChIP berbasis microarray menghibridisasi DNA yang diperkaya ChIP ke microarray tiling yang mencakup daerah genomik yang diminati. DNA masukan dilabeli dengan satu fluorofor dan DNA ChIP dengan yang lain. Daerah genomik dengan rasio tinggi sesuai dengan situs pengikatan. Resolusi dibatasi oleh ukuran fragmen dan jarak probe. ChIP-on-chip sebagian besar telah digantikan oleh ChIP-seq.

ChIP-Sequencing

ChIP-seq menggabungkan ChIP dengan pengurutan generasi berikutnya. Fragmen DNA yang diimunopresipitasi diurutkan, dan bacaan diselaraskan ke genom referensi. Daerah dengan pengayaan bacaan signifikan secara statistik, disebut puncak, menunjukkan situs pengikatan protein. ChIP-seq memberikan resolusi lebih tinggi, kebisingan lebih rendah, dan cakupan seluruh genom tanpa memerlukan probe yang telah ditentukan. Algoritma pemanggilan puncak seperti MACS mengidentifikasi daerah di mana kepadatan bacaan secara signifikan melebihi distribusi latar belakang.

Analisis Data

Analisis data ChIP-seq dimulai dengan kontrol kualitas, penyelarasan bacaan, dan penghapusan duplikat PCR. Pemanggilan puncak mengidentifikasi daerah yang diperkaya menggunakan model Poisson atau binomial negatif. Koreksi pengujian berganda mengontrol laju penemuan palsu. Analisis hilir meliputi anotasi puncak ke gen terdekat, penemuan motif untuk mengidentifikasi preferensi sekuens, dan perbandingan antar kondisi.

Aplikasi

ChIP-seq memetakan situs pengikatan faktor transkripsi di seluruh genom, mengungkapkan jaringan pengatur yang mengendalikan ekspresi gen. Ini memetakan pola modifikasi histon yang menentukan promotor aktif, penambah, dan kromatin yang direpresi. ChIP-seq untuk RNA polimerase II mengidentifikasi gen yang ditranskripsi dan polimerase yang dijeda. Proyek ENCODE dan Roadmap Epigenomics menghasilkan ribuan kumpulan data ChIP-seq, menciptakan peta komprehensif lanskap pengatur genom manusia.