Hematoksilin dan eosin (H&E) adalah pewarnaan yang paling banyak digunakan dalam histopatologi, diterapkan pada hampir setiap irisan jaringan diagnostik. Memahami kimianya, variasi formulasi, dan masalah umum sangat penting untuk menghasilkan kaca objek diagnostik berkualitas tinggi secara konsisten.
Kimia Hematoksilin
Hematoksilin adalah pewarna alami yang diekstraksi dari kayu jantung pohon logwood (Haematoxylon campechianum). Ini sendiri bukan pewarna — ia harus dioksidasi menjadi hematein, agen pewarna aktif. Oksidasi terjadi secara alami dengan paparan udara dan cahaya (pematangan) atau secara artifisial menggunakan oksidator kimia (natrium iodat, merkuri oksida). Hematein berikatan dengan mordan logam (aluminium, besi, tungsten) untuk membentuk kompleks lak berwarna yang mengikat komponen jaringan.
Hematoksilin tawas (Harris, Gill, Mayer, Gill II) menggunakan garam aluminium sebagai mordan dan mewarnai inti biru. Hematoksilin Harris menggunakan merkuri oksida sebagai oksidator dan dimatangkan; ini menghasilkan detail inti yang tajam tetapi memerlukan filtrasi sebelum digunakan untuk menghilangkan merkuri yang mengendap. Hematoksilin Gill menggunakan natrium iodat sebagai oksidator kimia dan siap digunakan tanpa pematangan — lebih stabil dan menghasilkan hasil yang konsisten. Hematoksilin Mayer serupa tetapi lebih encer, memerlukan waktu pewarnaan yang lebih lama.
Kimia Eosin
Eosin adalah pewarna xanthene yang tersedia dalam dua bentuk: eosin Y (kekuningan, paling umum) dan eosin B (kebiruan). Eosin Y larut dalam air dan digunakan dalam larutan berair atau alkohol. Ini adalah pewarna asam yang berikatan dengan komponen jaringan basa (kationik) — protein sitoplasma, kolagen, sel darah merah, dan granula sekretori. Larutan eosin biasanya mengandung asam asetat untuk meningkatkan pewarnaan sel darah merah dan mencegah pewarnaan berlebihan kolagen.
Protokol Pewarnaan H&E
Pewarna H&E otomatis memproses kaca objek melalui bak sekuensial: deparafinisasi (xylene, 3x pergantian), hidrasi (etanol bertingkat 100% hingga 70%, kemudian air), hematoksilin (3-8 menit tergantung formulasi dan intensitas yang diinginkan), pembiruan (Scott’s tap water atau ammonia water, yang menggeser hematoksilin dari merah ke biru pada pH alkalin), eosin (1-3 menit), dehidrasi (etanol bertingkat 70% hingga 100%), penjernihan (xylene), dan pemasangan kaca penutup dengan medium mounting permanen. Total waktu siklus pada pewarna otomatis sekitar 30-45 menit.
Pemecahan Masalah H&E
Pewarnaan inti pucat atau lemah — hematoksilin mungkin habis (ganti), konsentrasi mordan mungkin rendah, atau waktu pewarnaan tidak mencukupi. Periksa apakah hematoksilin telah teroksidasi melewati masa pakainya (hematoksilin terlalu matang berubah menjadi coklat tua dan mewarnai dengan buruk). Dekalsifikasi berlebihan spesimen tulang juga mengurangi basofilia inti.
Inti keruh atau terwarnai berlebihan — waktu pewarnaan hematoksilin terlalu lama, langkah pembiruan tidak mencukupi, atau larutan hematoksilin terlalu pekat. Bedakan dari ketebalan irisan yang terlalu tebal (irisan harus 3-5 µm).
Eosin mendominasi hematoksilin — konsentrasi eosin terlalu tinggi, pH eosin terlalu asam, atau hematoksilin terlalu lemah. Kurangi waktu eosin atau tingkatkan waktu hematoksilin. Intensitas eosin yang bervariasi di seluruh irisan sugestif pemrosesan jaringan yang tidak merata.
Warna biru berlebihan — diferensiasi tidak mencukupi dalam alkohol asam (1% HCl dalam etanol 70%), atau waktu eosin tidak memadai. Periksa apakah alkohol asam belum habis.
Pewarnaan inti dan sitoplasma keduanya lemah — ketebalan irisan terlalu tipis (kurang dari 3 µm), jaringan terlalu fiksasi dalam formalin, atau deparafinisasi tidak memadai (terbawa xylene ke dalam hematoksilin berair).
Kontrol Mutu
QC harian untuk H&E mencakup kaca objek kontrol (jaringan dengan detail inti dan sitoplasma yang diketahui — tonsil atau usus besar), penilaian kontras inti/sitoplasma, keseragaman di seluruh kaca objek, tidak adanya endapan, dan pemasangan kaca penutup yang tepat tanpa gelembung. Dokumentasikan hasil QC dan tindakan korektif. Larutan H&E harus diganti sesuai jadwal (hematoksilin setiap 1-2 minggu atau setelah 500-1000 kaca objek; eosin setiap 1-2 minggu). Perawatan rutin peralatan pewarnaan — membersihkan rak, memeriksa level cairan, mengkalibrasi pengatur waktu — mencegah kegagalan batch.
