PCR transkripsi balik (RT-PCR) adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi dan mengamplifikasi RNA. Ini menggabungkan dua langkah: transkripsi balik RNA menjadi DNA komplementer (cDNA), diikuti oleh amplifikasi PCR dari cDNA. Ini memungkinkan ilmuwan mempelajari ekspresi gen dan mendeteksi virus RNA.
Cara Kerja RT-PCR
- Ekstraksi RNA
Total RNA diekstraksi dari sampel dan diperlakukan dengan DNase untuk menghilangkan kontaminasi DNA genomik. Kualitas dan konsentrasi RNA diperiksa sebelum melanjutkan.
- Transkripsi Balik
RNA dicampur dengan enzim transkriptase balik, primer acak atau primer oligo-dT, dan nukleotida. Transkriptase balik menggunakan RNA sebagai templat untuk mensintesis untai DNA komplementer. Templat RNA kemudian didegradasi oleh RNase H, meninggalkan cDNA untai tunggal.
- Amplifikasi PCR
cDNA kemudian digunakan sebagai templat untuk PCR standar dengan primer spesifik gen. PCR mengamplifikasi cDNA, menghasilkan cukup DNA untuk divisualisasikan pada gel atau dikuantifikasi oleh qPCR.
- Deteksi
Produk PCR yang diamplifikasi dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa. Kehadiran pita pada ukuran yang diharapkan mengonfirmasi bahwa RNA target ada dalam sampel asli.
- Aplikasi
RT-PCR banyak digunakan untuk mengukur tingkat ekspresi gen, mendeteksi virus RNA seperti HIV dan SARS-CoV-2, memvalidasi data sekuensing RNA, dan menganalisis penyambungan alternatif. Ketika dikombinasikan dengan qPCR, ia menjadi RT-qPCR, memungkinkan kuantifikasi RNA secara real-time.
