Histopatologi adalah pemeriksaan mikroskopis jaringan sakit. Sebelum patolog dapat mengevaluasi spesimen, jaringan harus menjalani serangkaian langkah persiapan yang mempertahankan struktur, mengeraskan sampel untuk pemotongan, dan menghasilkan irisan yang cukup tipis untuk mentransmisikan cahaya. Kualitas diagnosis akhir secara langsung tergantung pada kualitas pemrosesan dan pemotongan.
Fiksasi
Fiksasi mempertahankan arsitektur jaringan dengan mengikat-silang protein dan menginaktivasi enzim degradatif. Fiksatif paling umum adalah formalin buffer netral 10% (NBF), larutan formaldehida 3,7% yang membentuk jembatan metilen antara gugus amino, menstabilkan struktur protein tanpa penyusutan berlebihan. Waktu fiksasi tergantung pada ukuran jaringan — biopsi tipikal memerlukan 6-24 jam, sementara spesimen yang lebih besar mungkin memerlukan 24-48 jam. Fiksasi kurang membuat jaringan rentan terhadap autolisis dan menghasilkan irisan yang diwarnai dengan buruk; fiksasi berlebihan menyebabkan pengikatan-silang berlebihan yang menutupi antigen untuk imunohistokimia. Fiksatif lain termasuk glutaraldehida (untuk mikroskop elektron), larutan Bouin (untuk jaringan endokrin), dan fiksatif berbasis alkohol (untuk pemrosesan cepat pada irisan beku).
Pemrosesan
Setelah fiksasi, jaringan harus diinfiltrasi dengan medium pendukung padat — biasanya parafin — sebelum pemotongan. Pemrosesan terjadi dalam pemroses jaringan otomatis selama 12-24 jam melalui tahap sekuensial:
Dehidrasi menghilangkan air dari jaringan menggunakan etanol bertingkat (70%, 80%, 95%, 100%) untuk mencegah distorsi. Dehidrasi tidak lengkap mencegah penetrasi parafin dan menyebabkan artefak pemotongan.
Penjernihan menggantikan etanol dengan pelarut organik yang dapat bercampur dengan alkohol dan parafin. Xylene adalah agen penjernih paling umum; ini membuat jaringan tembus cahaya dan mempersiapkannya untuk infiltrasi.
Infiltrasi menggantikan agen penjernih dengan parafin cair dalam oven vakum, memastikan penetrasi lengkap ke seluruh blok jaringan. Vakum menghilangkan gelembung udara yang sebaliknya akan menyebabkan lubang pada irisan.
Embedding
Embedding mengorientasikan jaringan yang telah diinfiltrasi dalam blok parafin untuk pemotongan. Jaringan ditempatkan dalam cetakan logam, ditutupi dengan lilin cair, dan didinginkan di atas pelat dingin hingga padat. Orientasi yang benar sangat penting: sebagian besar biopsi di-embed untuk menyajikan luas penampang maksimal ke pisau mikrotom. Spesimen kecil atau terfragmentasi (biopsi jarum, blok sel dari sitologi) sering dibungkus dalam kertas lensa atau di-embed dalam agar sebelum pemrosesan untuk mencegah kehilangan.
Mikrotomi
Pemotongan dilakukan pada mikrotom putar yang memajukan blok parafin dengan peningkatan presisi — biasanya 3-5 µm untuk histologi rutin. Pita irisan mengapung di atas penangas air panas (40-45°C) untuk meratakan kerutan, kemudian dikumpulkan ke kaca objek. Faktor yang mempengaruhi kualitas irisan meliputi kondisi pisau (pisau sekali pakai diganti secara teratur), suhu blok (mendinginkan blok di atas es meningkatkan pemotongan jaringan berlemak), dan kecepatan pemotongan (goresan lambat dan merata menghasilkan pita terbaik).
Setelah pemasangan, irisan dikeringkan di atas hot plate atau dalam oven untuk memastikan adhesi. Pewarnaan berikutnya (paling umum H&E — hematoksilin dan eosin) mengungkapkan detail inti dan sitoplasma untuk evaluasi mikroskopis.
Artefak Umum
Bekas pisau muncul sebagai garis skor paralel dari goresan pada pisau mikrotom; dapat diminimalkan dengan menggunakan ujung pisau segar untuk jaringan keras.
Kompresi terjadi ketika blok terlalu hangat atau pisau tumpul, menyebabkan irisan lebih pendek dari permukaan blok. Mendinginkan blok atau mengganti pisau mengatasi ini.
Chatter (pita tebal dan tipis bergantian) akibat getaran pada mikrotom atau blok longgar — blok harus diamankan dengan kuat di chuck.
Lipatan dan kerutan pada irisan disebabkan oleh pengapungan yang tidak tepat di penangas air atau panas berlebihan; menambahkan setetes deterjen ke air mengurangi tegangan permukaan.
Artefak mengambang adalah fragmen jaringan dari kasus lain yang mengontaminasi penangas air — menyaring penangas air dan menggantinya setiap hari mencegah kontaminasi silang.
Gelembung timbul dari infiltrasi parafin yang tidak lengkap selama pemrosesan, meninggalkan udara terperangkap di jaringan. Pemrosesan ulang di bawah vakum mungkin diperlukan.
Kontrol Mutu
Setiap kaca objek yang diwarnai harus diperiksa untuk ketebalan irisan (3-5 µm seragam), tidak adanya lipatan dan robekan, representasi lengkap jaringan, dan pelabelan yang benar. Irisan yang tidak memadai harus dipotong ulang sebelum patolog meninjau kasus. Pemrosesan dan pemotongan yang tepat adalah prasyarat untuk diagnosis histopatologis yang akurat dan untuk teknik hilir seperti imunohistokimia, hibridisasi in situ, dan patologi digital.
