CRISPR技术已远远超出使用Cas9的基因组编辑，扩展到包括碱基编辑、先导编辑、基因调控和诊断应用。这些进展已经改变了分子生物学、生物技术和医学。

Cas9之外：CRISPR工具箱

CRISPR-Cas系统是细菌和古菌的适应性免疫系统，其组件已被改造用于多种应用。来自化脓链球菌的Cas9是第一个广泛使用的编辑酶，在单指导RNA引导下产生双链断裂。Cas12a（以前称为Cpf1）产生交错切口并加工自身的pre-crRNA，简化了多重化。Cas13靶向RNA而非DNA，并具有附带切割活性。Cas14靶向单链DNA。

CRISPR干扰

催化失活的Cas9（在两个核酸酶结构域都有突变）保留DNA结合能力但不能切割。将dCas9与抑制结构域如KRAB融合创建CRISPRi，通过阻断转录起始或延伸来沉默基因表达。与RNA干扰不同，CRISPRi在DNA水平起作用，产生更完全和特异的抑制。

CRISPRi具有高度特异性，脱靶效应最小。它可用于细菌和哺乳动物细胞，并且在dCas9表达关闭时可逆。靶向启动子或编码序列的前几百个碱基对产生最强的抑制。使用多个指导RNA的多重CRISPRi可以同时抑制几个基因。

CRISPR激活

dCas9与激活结构域如VP64或VPR融合创建CRISPRa，激活内源基因表达。最强的激活使用协同激活介质系统，其中多个激活结构域通过抗体-表位相互作用被招募到靶启动子。CRISPRa从天然基因组背景激活基因表达，保留剪接和调控元件。

CRISPRa可以激活在特定细胞类型中沉默的基因，使得无需克隆cDNA即可进行基因功能研究。它已被用于鉴定赋予耐药性的基因、重编程细胞身份以及筛选参与特定生物过程的基因。CRISPRa筛选使用靶向所有已知启动子的指导RNA文库。

碱基编辑

碱基编辑直接将一个DNA碱基转换为另一个碱基，而不产生双链断裂。胞嘧啶碱基编辑器将胞苷脱氨酶与Cas9切口酶融合，在5核苷酸编辑窗口内将C转换为T。腺嘌呤碱基编辑器使用工程化的脱氨酶将A转换为G。切口酶在未编辑链上产生单链切口，促进使用编辑链作为模板进行修复。

碱基编辑高效且产生比Cas9编辑更少的非预期结果。它不能引入任意编辑，但可以纠正约60%的疾病相关点突变。BE4和ABE7.10是优化后的碱基编辑器，具有更高的效率和减少的脱靶编辑。碱基编辑已应用于模式生物、植物和临床前基因治疗。

先导编辑

先导编辑使用Cas9切口酶与逆转录酶融合，以及既指定靶位点又编码所需编辑的先导编辑指导RNA。pegRNA包括引物结合位点和包含编辑的逆转录模板。在靶链产生切口后，RT模板用于合成编辑后的DNA。细胞修复途径掺入编辑后的序列。

先导编辑可以安装所有可能的单核苷酸替换以及小的插入和缺失，无需双链断裂或供体模板。脱靶编辑低于Cas9或碱基编辑器。先导编辑效率因靶位点和细胞类型而异，正在进行的优化旨在改善递送和活性。

CRISPR诊断

Cas12和Cas13具有附带切割活性：识别其靶核酸后，它们非特异性切割附近的单链DNA或RNA。这一特性已被用于分子诊断。DETECTR使用Cas12a，SHERLOCK使用Cas13来检测特定核酸序列。

当靶序列存在时，报告分子的附带切割产生荧光或比色信号。这些系统达到阿托摩尔灵敏度，可以区分单核苷酸变体。CRISPR诊断已开发用于病毒检测，包括SARS-CoV-2、寨卡和登革热，无需复杂设备在不到一小时内即可读取结果。

CRISPR筛选

靶向数千个基因的CRISPR文库实现基因组规模的功能筛选。指导RNA文库递送到细胞池中，每个敲除的效果通过使用PCR测量指导RNA的富集或耗竭来评估。正选择筛选鉴定其敲除赋予生长优势的基因。负选择筛选鉴定细胞存活必需的基因。CRISPR筛选具有比RNAi筛选更高的灵敏度和更低的噪声。