CRISPR 技术已远远超出了 使用 Cas9 进行基因组编辑，包括碱基编辑、引物编辑、基因调控和诊断应用。这些进步改变了分子生物学、生物技术和医学。

超越 Cas9：CRISPR 工具箱

CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌中的适应性免疫系统，其组件已适应不同的应用。来自化脓性链球菌的 Cas9 是第一个广泛使用的编辑酶，可在单个引导 RNA 的引导下产生双链断裂。 Cas12a（以前称为 Cpf1）创建交错切割并处理其自己的 pre-crRNA，从而简化了多重分析。 Cas13 靶向 RNA 而不是 DNA，并且具有附带切割活性。 Cas14 靶向单链 DNA。

CRISPR 干扰

催化死亡的 Cas9 在两个核酸酶结构域都有突变，保留 DNA 结合但不能切割。 dCas9 与 KRAB 等阻遏物结构域的融合产生了 CRISPRi，它通过阻断转录起始或延伸来沉默基因表达。与 RNA 干扰不同，CRISPRi 在 DNA 水平上发挥作用，产生更完整和特异性的抑制。

CRISPRi 具有高度特异性，脱靶效应最小。它可用于细菌和哺乳动物细胞，并且当 dCas9 表达关闭时是可逆的。靶向启动子或编码序列的前几百个碱基对会产生最强的抑制。具有多个引导 RNA 的多重 CRISPRi 可以同时抑制多个基因。

CRISPR 激活

dCas9 与 VP64 或 VPR 等激活结构域融合，产生 CRISPRa，从而激活内源基因表达。最强的激活使用协同激活介体系统，其中多个激活剂结构域通过抗体表位相互作用招募到目标启动子。 CRISPRa 激活自然基因组环境中的基因表达，保留剪接和调控元件。

CRISPRa 可以激活细胞类型中原本沉默的基因，从而无需克隆 cDNA 即可进行基因功能研究。它已被用于鉴定赋予耐药性的基因、重新编程细胞身份以及筛选参与特定生物过程的基因。 CRISPRa 筛选使用针对所有已知启动子的引导 RNA 文库。

基础编辑

碱基编辑直接将一个 DNA 碱基转换为另一个碱基，而不会产生双链断裂。胞嘧啶碱基编辑器将胞苷脱氨酶与 Cas9 切口酶融合，在 5 核苷酸编辑窗口内将 C 转换为 T。腺嘌呤碱基编辑器使用工程脱氨酶将 A 转化为 G。切口酶在未编辑的链上创建单链切口，从而使用编辑的链作为模板促进修复。

碱基编辑效率很高，并且比 Cas9 编辑产生更少的不良结果。它不能引入任意编辑，但可以纠正约 60% 的疾病相关点突变。 BE4 和 ABE7.10 是优化的碱基编辑器，可提高效率并减少脱靶编辑。碱基编辑已应用于模式生物、植物和临床前基因治疗。

优质编辑

Prime 编辑使用与逆转录酶融合的 Cas9 切口酶，以及 Prime 编辑引导 RNA，既指定目标位点又编码所需的编辑。 pegRNA 包括引物结合位点和包含编辑的逆转录模板。目标链切口后，RT 模板用于合成编辑后的 DNA。细胞修复途径包含编辑后的序列。

Prime 编辑可以安装所有可能的单核苷酸替换，以及小的插入和删除，而不需要双链断裂或供体模板。脱靶编辑低于 Cas9 或碱基编辑器。 Prime 编辑效率因目标位点和细胞类型而异，持续优化旨在提高递送和活性。

CRISPR 诊断

Cas12 和 Cas13 具有附带切割活性：在识别其靶核酸后，它们非特异性切割附近的单链 DNA 或 RNA。该特性已被用于分子诊断。 DETECTR 使用 Cas12a，SHERLOCK 使用 Cas13 来检测特定的核酸序列。

当靶序列存在时，报告分子的附带裂解会产生荧光或比色信号。这些系统实现了阿托摩尔级的灵敏度，并且可以区分单核苷酸变异。 CRISPR 诊断技术已开发用于病毒检测，包括 SARS-CoV-2、寨卡病毒和登革热，无需复杂设备，一小时内即可读取结果。

CRISPR 筛选

针对数千个基因的 CRISPR 文库可实现基因组规模的功能筛选。将引导 RNA 文库递送至细胞库，并使用 PCR 通过引导 RNA 富集或耗尽来测量每次敲除的效果。正选筛选可识别敲除具有生长优势的基因。负选择筛选识别细胞生存必需的基因。 CRISPR 筛选比 RNAi 筛选具有更高的灵敏度和更低的噪音。