CRISPR/Cas9 是一项革命性的基因编辑技术，使科学家能够对生物体的 DNA 进行精确的改变。它最初是作为一种细菌免疫系统被发现的，现已成为基因研究、医学和生物技术的多功能工具。
CRISPR/Cas9 的工作原理
- 指导 RNA 设计
短引导 RNA (gRNA) 被设计为与目标 DNA 序列互补。 gRNA 大约长 20 个核苷酸，决定 Cas9 酶的切割位置。靶序列后面必须直接跟有原型间隔子相邻基序 (PAM) 序列，通常是 NGG。
- 复杂的阵型
gRNA 与 Cas9 蛋白结合，形成核糖核蛋白复合物。 gRNA 充当 GPS，引导 Cas9 到达基因组中与 gRNA 序列匹配的确切位置。
- DNA 结合和切割
Cas9-gRNA 复合物扫描 DNA 中的 PAM 序列。一旦找到，Cas9 就会解开 DNA 并检查相邻序列是否与 gRNA 匹配。如果匹配，Cas9 就会在 DNA 中产生双链断裂。
4.DNA修复
细胞的自然修复机制开始发挥作用。主要有两条途径：
- 非同源末端连接 (NHEJ)：断裂的末端直接重新连接，通常会导致小插入或缺失，从而破坏基因。
- 同源定向修复（HDR）：如果提供修复模板，细胞将使用它进行精确编辑或插入新的遗传物质。
- 验证
通过 PCR 和测序分析编辑后的细胞或生物体，以确认所需的基因修饰是否成功。
实用 CRISPR 实验设计
使用 CRISPick (Broad Institute) 或 CHOPCHOP 等在线工具设计向导 RNA。输入目标基因序列并选择预测脱靶位点最少（低 MIT 分数）的排名最高的 gRNA。将 gRNA 作为两个带有突出端的互补寡核苷酸订购，用于克隆到表达载体中（例如，用于 SpCas9 和嘌呤霉素选择的 pX459），或购买体外转录的 gRNA 和重组 Cas9 蛋白用于 RNP 递送。对于 RNP 形成，将 100 pmol Cas9 蛋白与 120 pmol gRNA 在 10 µL PBS 中混合，在室温下孵育 15 分钟。使用 Neon 或 Lonza 系统以及针对细胞类型的推荐程序，通过电穿孔将 RNP 递送到 2 × 10^5 细胞中。 48 小时后，提取基因组 DNA 并 PCR 扩增目标区域（以切割位点为中心的 300-600 bp）。 Sanger 对 PCR 产物进行测序，并使用 ICE（CRISPR 编辑推断）或 TIDE 软件分析色谱图 - 这些工具分解混合痕迹以量化编辑效率（插入/缺失百分比）并识别最常见的编辑。典型的成功实验在 HEK293T 细胞中产生 30-80% 的编辑效率。对于 HDR 介导的精确编辑，每个反应以 10 pmol 的浓度共同提供单链寡脱氧核苷酸 (ssODN) 修复模板（100–200 nt，每侧 50 nt 同源臂）。
实际应用
在 HCT116 细胞中 TP53 基因的敲除研究中，通过 CRISPick 设计了靶向外显子 4 的 gRNA。通过ICE分析，RNP电穿孔实现了65%的编辑效率。单细胞克隆分离出经桑格测序证实的纯合敲除克隆，显示 2 bp 缺失导致移码和过早终止密码子。蛋白质印迹证实不存在 p53 蛋白。
