La citometría de flujo es una tecnología basada en láser que mide rápidamente las propiedades físicas y químicas de miles de células individuales por segundo mientras fluyen en una corriente de fila única frente a detectores ópticos. Permite el análisis multiparamétrico de poblaciones celulares con resolución de célula única.

Principios

Las células en suspensión se enfocan hidrodinámicamente en una corriente estrecha, asegurando que pasen individualmente a través del punto de interrogación donde uno o más haces láser intersectan la corriente. A medida que cada célula pasa a través del láser, dispersa la luz y emite fluorescencia si está marcada con fluoróforos. La luz dispersada y emitida es recolectada por detectores, convertida en señales electrónicas y digitalizada para análisis.

Dispersión Frontal y Lateral

La dispersión frontal mide la luz dispersada en ángulos pequeños, correlacionándose con el tamaño celular. Las células más grandes dispersan más luz en la dirección frontal. La dispersión lateral mide la luz dispersada a 90 grados, reflejando la granularidad celular y la complejidad interna. Los neutrófilos con muchos gránulos tienen alta dispersión lateral, mientras que los linfocitos tienen baja dispersión lateral. Juntos, FSC y SSC pueden distinguir las principales poblaciones de leucocitos en sangre sin necesidad de tinción.

Detección de Fluorescencia

La fluorescencia se emite cuando los fluoróforos excitados por el láser regresan a su estado fundamental. Las células típicamente se tiñen con anticuerpos conjugados con fluoróforos dirigidos a marcadores de superficie o intracelulares específicos, similar a la detección basada en anticuerpos en ELISA. Cada fluoróforo tiene espectros de excitación y emisión característicos. Los citómetros de flujo usan espejos dicroicos y filtros de paso de banda para separar la fluorescencia en canales de detector distintos, cada uno midiendo un rango de longitud de onda específico.

Fluoróforos

Los fluoróforos comunes incluyen FITC, PE, APC, PerCP y tintes Alexa Fluor. Los tintes en tándem como PE-Cy7 combinan dos fluoróforos, donde la transferencia de energía del donante al aceptor produce un gran desplazamiento de Stokes. Los citómetros modernos pueden medir 12 a 50 parámetros simultáneamente usando múltiples láseres y detectores.

La compensación corrige la superposición espectral entre fluoróforos. Cuando el espectro de emisión de un fluoróforo se derrama en el detector de otro, la contribución debe restarse matemáticamente. Los controles de compensación usando muestras teñidas individualmente son esenciales para un análisis multicolor preciso.

Clasificación Celular

La clasificación celular activada por fluorescencia separa físicamente las células según sus propiedades medidas. El clasificador usa una boquilla vibratoria para generar gotitas que contienen células individuales. Las gotitas se cargan eléctricamente según las características medidas de la célula y se desvían mediante placas electrostáticas hacia tubos de recolección. La pureza de clasificación típicamente supera el 95%. La clasificación aséptica es posible para cultivo posterior o ensayos funcionales.

Aplicaciones

La inmunofenotipificación identifica y cuantifica subconjuntos de células inmunes usando paneles de marcadores específicos de linaje. Los recuentos de células T CD4 en el monitoreo del VIH son una aplicación clínica de la citometría de flujo. El análisis del ciclo celular mide el contenido de ADN usando yoduro de propidio o tinción DAPI, identificando poblaciones en fase G1, S, G2 y M.

Los ensayos de apoptosis detectan la exposición de fosfatidilserina con anexina V, la permeabilidad de membrana con yoduro de propidio o 7-AAD, y la activación de caspasas con inhibidores fluorescentes. La tinción de citoquinas intracelulares mide la producción de citoquinas en células T activadas. El phospho-flow mide la fosforilación de proteínas de señalización con resolución de célula única, análogo al análisis de Western blot. La expresión de proteínas fluorescentes a partir de reporteros como GFP puede medirse sin tinción con anticuerpos.

Citometría de Flujo Espectral

La citometría de flujo espectral usa una rejilla de difracción o prisma para capturar el espectro de emisión completo de cada célula a través de muchos detectores, en lugar de medir en canales discretos. Los algoritmos de desmezclado espectral deconvolucionan la contribución de cada fluoróforo. Este enfoque acomoda más fluoróforos con espectros similares y simplifica el diseño del panel al reducir los requisitos de compensación.

Citometría de Masas

La citometría de masas usa anticuerpos conjugados con isótopos de metales pesados estables en lugar de fluoróforos. Las células se introducen en un espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente, que atomiza e ioniza los metales. Cada masa de isótopo se mide mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo. La citometría de masas puede medir 40 o más parámetros sin superposición espectral ni autofluorescencia. Sin embargo, las células se destruyen durante el análisis y no pueden recuperarse. La tecnología tiene menor rendimiento que la citometría de flujo convencional.