Übersicht
Die gezielte Proteomik konzentriert sich auf die Quantifizierung eines vordefinierten Satzes von Proteinen mit hoher Empfindlichkeit, Spezifität und hohem Durchsatz, im Gegensatz zur Entdeckungsproteomik, die auf eine breite, nicht zielgerichtete Abdeckung abzielt. Die am weitesten verbreitete Technik ist das Selected Reaction Monitoring (SRM, auch Multiple Reaction Monitoring oder MRM genannt), das auf Triple-Quadrupol-Massenspektrometern durchgeführt wird. SRM-Assays zielen auf spezifische Peptid-Vorläufer-Fragment-Übergänge ab, sogenannte proteotypische Peptide, die das Protein von Interesse eindeutig darstellen. Dieser Ansatz liefert eine mit Immunoassays vergleichbare quantitative Präzision und bietet gleichzeitig eine höhere Multiplexfähigkeit und eine schnellere Assay-Entwicklung.
Methoden
Die Assay-Entwicklung beginnt mit der Auswahl proteotypischer Peptide – Peptide, die für das Zielprotein einzigartig sind, im Massenspektrometer gut fliegen und intensive Fragmentionen produzieren. Für jedes Peptid werden mehrere Übergänge (Vorläuferion m/z zum Fragmention m/z) über den gesamten chromatographischen Elutionszeitraum überwacht. Interne Standards, typischerweise mit stabilen Isotopen markierte Versionen der Zielpeptide, werden in bekannten Konzentrationen in die Probe gegeben, um eine absolute Quantifizierung zu ermöglichen. Parallel Reaction Monitoring (PRM) auf Orbitrap-Instrumenten bietet einen verwandten Ansatz mit hochauflösender Vollspektrumerfassung. Datenunabhängige Erfassungsmethoden (DIA) wie SWATH-MS schließen die Lücke zwischen Entdeckung und gezielter Analyse, indem sie alle Fragmentionen aller Vorläufer systematisch erfassen.
Praktisches Protokoll
Die Entwicklung eines SRM/MRM-Assays beginnt mit der Identifizierung proteotypischer Peptide für das Zielprotein. Mithilfe von Spektralbibliotheken von PeptideAtlas oder SRMAtlas wählt der Forscher Peptide aus, die 7 bis 25 Aminosäuren lang sind, keine fehlenden Spaltstellen aufweisen, Methionin und Tryptophan (die zur Oxidation neigen) meiden und aus Massenspektrometriedaten intensive Y- oder B-Ionenfragmente erzeugen. Für jedes Peptid werden 3–5 Übergänge ausgewählt – die 3–5 intensivsten Fragmentionen aus dem Bibliotheksspektrum. Für jedes Ziel wird ein mit schwerem Isotop markiertes Standardpeptid synthetisiert, das 13C/15N-markiertes Arginin oder Lysin enthält, um eine Massenverschiebung von 6–10 Da zu erzeugen. Der schwere Standard wird je nach Quantifizierungsstrategie vor dem Aufschluss oder nach dem Aufschluss in einer bekannten Konzentration in jede Probe gegeben. Das Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer ist so konfiguriert, dass Q1 und Q3 die Vorläufer- bzw. Fragment-m/z-Werte übertragen, während Q2 eine kollisionsinduzierte Fragmentierung bei optimierten Kollisionsenergien durchführt, die für jeden Übergang spezifisch sind. Das geplante SRM überwacht jeden Übergang innerhalb eines Retentionszeitfensters von 2–3 Minuten und maximiert so die Anzahl der pro Lauf quantifizierten Peptide. Rohdaten werden in Skyline verarbeitet: Chromatografische Peaks werden integriert, Retentionszeiten werden anhand des schweren internen Standards bestätigt und das Flächenverhältnis von leichten zu schweren Peaks wird berechnet. Aus diesem Verhältnis und der bekannten Standardkonzentration wird die absolute Konzentration abgeleitet. Ein Beispiel aus der Praxis: Für die Früherkennung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs wurde ein Multiplex-MRM-Assay zur Quantifizierung von 50 krebsassoziierten Proteinen im Plasma entwickelt, der bei 35 der 50 Ziele Nachweisgrenzen unter 1 ng/ml erreicht. Der Assay wurde anhand von 500 Patientenproben mit Variationskoeffizienten unter 15 % validiert.
Anwendungen
Die gezielte Proteomik ist die Methode der Wahl zur Verifizierung und Validierung möglicher Biomarker, die in ungezielten Studien entdeckt wurden. Es wird in der klinischen Forschung häufig zur Quantifizierung von Proteingruppen eingesetzt, die mit bestimmten Krankheiten in Zusammenhang stehen. Die Assays ergänzen traditionelle ELISA Messungen, bieten eine Alternative zu gelbasierten Ansätzen und Kapillargelelektrophorese und können gemultiplext werden, um Dutzende von Proteinen in einem einzigen Lauf zu verfolgen. Die Integration mit der HPLC-Trennung und der Massenspektrometrie-Detektion gewährleistet eine robuste Quantifizierung, während Proteinquantifizierung-Assays eine orthogonale Validierung der Gesamtproteinkonzentration ermöglichen.
