Unter Proteinquantifizierung versteht man den Prozess der Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Lösung. Eine genaue Proteinquantifizierung ist für viele nachgelagerte Anwendungen unerlässlich, darunter SDS-PAGE, Western Blot, Enzymtests und Strukturstudien.

Gängige Methoden zur Proteinquantifizierung

Bradford-Assay

Der Bradford-Assay basiert auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 an Proteine. Der Farbstoff verschiebt sich von Braun nach Blau, wenn er an Protein gebunden ist, wobei sich das Absorptionsmaximum von 465 nm auf 595 nm ändert. Der Assay ist schnell, einfach und mit den meisten Puffern kompatibel. Bei Anwesenheit von Reinigungsmitteln ist die Genauigkeit geringer.

BCA-Assay

Der Bicinchoninsäure (BCA)-Assay beruht auf der Reduktion von Cu2+ zu Cu1+ durch Proteine in einem alkalischen Medium. BCA chelatiert dann das Cu1+ und bildet eine violette Farbe, die bei 562 nm absorbiert. Der BCA-Assay ist gegenüber Detergenzien toleranter als der Bradford-Assay, ist jedoch weniger kompatibel mit Reduktionsmitteln.

Lowry-Assay

Der Lowry-Assay kombiniert die Biuret-Reaktion (Kupferchelatbildung) mit dem Folin-Ciocalteu-Reagenz, das mit Tyrosin- und Tryptophanresten reagiert. Es erzeugt eine blaue Farbe, gemessen bei 750 nm. Es ist empfindlich, erfordert jedoch ein sorgfältiges Timing und wird durch viele störende Substanzen beeinflusst.

UV-Absorption (A280)

Proteine absorbieren UV-Licht bei 280 nm aufgrund von Tryptophan- und Tyrosinresten. Die Absorption bei 280 nm ermöglicht eine schnelle, zerstörungsfreie Schätzung der Proteinkonzentration. Es ist am genauesten für reine Proteine ​​mit bekannten Extinktionskoeffizienten.

Standardkurve

Alle kolorimetrischen Tests erfordern eine Standardkurve. Es werden Reihenverdünnungen eines bekannten Proteinstandards, typischerweise Rinderserumalbumin (BSA), hergestellt und gemessen. Die Absorption der unbekannten Probe wird mit der Standardkurve verglichen, um ihre Konzentration zu berechnen.