La tecnología del ADN recombinante combina moléculas de ADN de diferentes fuentes para crear nuevas combinaciones genéticas que no ocurren naturalmente. Es la base de la biología molecular moderna y ha permitido la producción de proteínas terapéuticas, organismos genéticamente modificados y la secuenciación de genomas completos.

Enzimas de Restricción

Las endonucleasas de restricción son enzimas bacterianas que cortan el ADN en secuencias de reconocimiento específicas, típicamente de 4 a 8 pares de bases de longitud. Las enzimas de restricción tipo II reconocen secuencias palindrómicas y cortan dentro del sitio de reconocimiento, produciendo extremos romos o cortes escalonados que crean extremos cohesivos con salientes monocatenarios cortos. EcoRI reconoce GAATTC y produce extremos cohesivos con un saliente AATT, mientras que SmaI reconoce CCCGGG y produce extremos romos. La especificidad de las enzimas de restricción permite generar y combinar fragmentos de ADN definidos, mientras que la PCR proporciona un método alternativo para amplificar secuencias de ADN específicas.

ADN Ligasa

La ADN ligasa sella mellas en el esqueleto del ADN catalizando la formación de un enlace fosfodiéster entre un hidroxilo 3-prima y un fosfato 5-prima. La ADN ligasa T4, la enzima más comúnmente utilizada para clonación, puede ligar tanto extremos cohesivos como romos. La ligación de extremos cohesivos es altamente eficiente porque los salientes complementarios alinean los fragmentos correctamente. La ligación de extremos romos es menos eficiente pero no requiere salientes compatibles. La enzima utiliza ATP como fuente de energía, formando un intermediario enzima-AMP que activa el fosfato 5-prima.

Vectores de Clonación

Los plásmidos son moléculas de ADN pequeñas y circulares que se replican independientemente del cromosoma bacteriano. Son los vectores más comunes para la clonación de ADN, portando un origen de replicación, un marcador seleccionable como un gen de resistencia a antibióticos y un sitio de clonación múltiple que contiene sitios de restricción únicos. La serie de plásmidos pUC utiliza el gen lacZ para el cribado azul-blanco, donde la inactivación por inserción de lacZ permite distinguir los recombinantes de los no recombinantes por su color blanco en placas con X-gal.

Los cromosomas artificiales bacterianos se basan en el factor F de E. coli y pueden transportar insertos de hasta 300 kilobases. Los cromosomas artificiales de levadura contienen secuencias centroméricas, teloméricas y de replicación para su propagación en levadura y pueden transportar insertos que superan un megabase. Estos vectores de inserto grande son esenciales para proyectos de mapeo y secuenciación de genomas.

Vectores de Expresión

Los vectores de expresión contienen secuencias reguladoras que dirigen la transcripción y traducción del gen clonado en un organismo huésped. Los vectores de expresión bacterianos utilizan promotores fuertes como el promotor T7 o tac, a menudo con un sistema inducible para expresión controlada. El operador lac permite la inducción con IPTG, y el sistema T7 utiliza la ARN polimerasa T7 bajo control de lac. Las etiquetas de fusión como 6xHis, GST o MBP se añaden a menudo para facilitar la purificación y detección.

Los vectores de expresión eucariotas utilizan promotores del citomegalovirus o del virus simio 40 para una expresión fuerte en células de mamífero. Incluyen una señal de poliadenilación para el procesamiento adecuado del ARNm y a menudo un marcador seleccionable como la resistencia a neomicina para la generación de líneas celulares estables. Los vectores virales derivados de AAV, lentivirus o retrovirus se utilizan cuando se requieren administración e integración eficientes.

Organismos Huésped

E. coli es el huésped más común para la clonación de ADN, ofreciendo crecimiento rápido, alta eficiencia de transformación y genética bien caracterizada. Existen cepas especializadas para propósitos específicos: DH5-alpha para clonación, BL21 para expresión de proteínas y CJ236 para generar moldes que contienen uracilo. La levadura, particularmente Saccharomyces cerevisiae, se utiliza para clonar fragmentos grandes de ADN y para expresar proteínas eucariotas que requieren modificaciones postraduccionales.

Las líneas celulares de mamífero como HEK293 y células CHO se utilizan para producir proteínas terapéuticas con patrones de glicosilación compatibles con humanos. Las células de insecto infectadas con vectores de baculovirus proporcionan altos rendimientos de proteínas con procesamiento eucariota. Los sistemas libres de células que utilizan extractos de E. coli, germen de trigo o reticulocitos de conejo permiten la producción rápida de proteínas sin células vivas.

Aplicaciones

La tecnología del ADN recombinante ha producido muchas proteínas terapéuticas. La insulina humana fue el primer recombinante terapéutico, producido en E. coli por Genentech y aprobado en 1982. Otras proteínas recombinantes incluyen la hormona del crecimiento, la eritropoyetina, el factor VIII para hemofilia y los anticuerpos monoclonales. La tecnología permite la producción de proteínas humanas en grandes cantidades sin depender de fuentes animales.

Los organismos genéticamente modificados se crean introduciendo ADN recombinante en plantas, animales o microorganismos. Los cultivos Bt expresan proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis. Los microbios recombinantes producen enzimas industriales, biocombustibles y productos bioquímicos. La tecnología también se utiliza para el análisis de la función génica, la creación de organismos knockout y transgénicos, y la producción de vacunas como el antígeno de superficie de la hepatitis B producido en levadura.