La ligadura y clonación del ADN es un conjunto de técnicas que se utilizan para unir fragmentos de ADN e insertarlos en un vector (una molécula de ADN portadora) para su replicación dentro de un organismo huésped, generalmente una bacteria. Esto permite a los científicos producir grandes cantidades de una secuencia de ADN específica.
Cómo funciona la ligadura y la clonación del ADN
- Preparando el Inserto y el Vector
Tanto el fragmento de ADN de interés (el inserto) como el vector (normalmente un plásmido) se cortan con las mismas enzimas de restricción. Esto crea extremos adhesivos complementarios: salientes cortos y monocatenarios que pueden emparejarse entre sí.
- Ligadura
El inserto cortado y el vector se mezclan con ADN ligasa, una enzima que sella la columna vertebral de azúcar y fosfato del ADN. Los extremos adhesivos complementarios se alinean y la ligasa forma enlaces covalentes, uniendo el inserto permanentemente al vector.
- Transformación
El plásmido ligado se introduce en células bacterianas competentes mediante un proceso llamado transformación. Esto a menudo se logra mediante choque térmico o electroporación, lo que hace que la membrana bacteriana sea temporalmente permeable al ADN.
- Selección
Las bacterias transformadas se siembran en placas de agar que contienen un antibiótico. El plásmido porta un gen de resistencia a los antibióticos, por lo que sólo sobreviven las bacterias que absorbieron el plásmido. Esto crea colonias, cada una de las cuales desciende de una sola célula que contiene el ADN clonado.
- Detección
Las colonias se analizan mediante PCR de colonias o digestión de restricción para confirmar que contienen el inserto correcto. Las colonias positivas se cultivan en cultivo líquido para producir grandes cantidades del plásmido deseado.
Protocolo práctico de ligadura
Calcule la relación molar óptima de inserto:vector usando la fórmula: masa del inserto (ng) = (masa del vector (ng) × tamaño del inserto (kb) / tamaño del vector (kb)) × relación deseada. Para la clonación estándar, utilice una relación molar de inserción:vector de 3:1. Configure una reacción de ligadura de 10 l: 50 ng de vector linealizado, la masa calculada del inserto, 1 l de 10 × tampón de ADN ligasa T4 (que contiene ATP), 1 l de ADN ligasa T4 (400 U/l) y agua a 10 l. Incluya dos controles: una ligadura de sólo vector (sin inserto) para medir el fondo de la autoligadura y un control sin ligasa. Incubar a 16°C durante 1 a 2 horas o a 4°C durante la noche para obtener la máxima eficacia. Para ligaduras de extremos romos, utilice 1 l de ligasa e incube a 16°C durante 16 horas. Después de la ligadura, transformar 2–5 l en 50 l de células competentes de E. coli mediante choque térmico: incubar en hielo durante 30 minutos, calentar a 42 °C durante 45 segundos, volver al hielo durante 2 minutos, agregar 950 l de medio SOC e incubar a 37 °C durante 1 hora con agitación. Placa de 100 l en agar LB con el antibiótico adecuado y, si utiliza un cribado azul-blanco, agregue 40 l de X-gal (20 mg/mL) y 40 l de IPTG (100 mM). Las colonias blancas indican una inserción exitosa (gen lacZ alterado), mientras que las colonias azules contienen un vector autoligado. Una buena ligadura debería producir entre 10 y 100 veces más colonias que el control de solo vector, con >70% de colonias blancas.
Aplicación del mundo real
Cuando se clona un gen GFP de 0,8 kb en pUC19 (2,7 kb) con una proporción molar de 3:1, la ligadura produce ~200 colonias en placas de ampicilina-X-gal. De ellos, 165 (82%) son blancos. La PCR de colonias en 10 colonias blancas confirma el inserto de GFP en las 10, lo que demuestra una ligadura y un cribado eficaces.
