La ligación y clonación de ADN es un conjunto de técnicas utilizadas para unir fragmentos de ADN e insertarlos en un vector—una molécula de ADN transportadora—para su replicación dentro de un organismo huésped, típicamente bacterias. Esto permite a los científicos producir grandes cantidades de una secuencia específica de ADN.
Cómo funciona la ligación y clonación de ADN
- Preparación del inserto y el vector
Tanto el fragmento de ADN de interés (el inserto) como el vector (generalmente un plásmido) se cortan con las mismas enzimas de restricción. Esto crea extremos cohesivos complementarios—salientes monocatenarios cortos que pueden aparearse por bases entre sí.
- Ligación
El inserto y el vector cortados se mezclan con ADN ligasa, una enzima que sella la columna vertebral de azúcar-fosfato del ADN. Los extremos cohesivos complementarios se alinean y la ligasa forma enlaces covalentes, uniendo permanentemente el inserto dentro del vector.
- Transformación
El plásmido ligado se introduce en células bacterianas competentes mediante un proceso llamado transformación. Esto se logra generalmente mediante choque térmico o electroporación, que hace que la membrana bacteriana sea temporalmente permeable al ADN.
- Selección
Las bacterias transformadas se siembran en agar que contiene un antibiótico. El plásmido porta un gen de resistencia a antibióticos, por lo que solo las bacterias que incorporaron el plásmido sobreviven. Esto crea colonias, cada una descendiente de una sola célula que contiene el ADN clonado.
- Cribado
Las colonias se examinan mediante PCR de colonias o digestión con enzimas de restricción para confirmar que contienen el inserto correcto. Las colonias positivas se cultivan en medio líquido para producir grandes cantidades del plásmido deseado.
