Sintesis asam amino mencakup jalur metabolisme dimana sel menghasilkan asam amino. Manusia dapat mensintesis sebelas dari dua puluh asam amino standar, sedangkan sembilan sisanya – disebut asam amino esensial – harus diperoleh dari makanan.
Asam Amino Esensial vs. Non-Esensial
Asam Amino Esensial
Manusia tidak dapat mensintesis histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, dan valin. Ini harus dipasok dari makanan. Kurangnya asam amino esensial menyebabkan kekurangan protein, karena sintesis protein memerlukan kedua puluh asam amino secara bersamaan.
Asam Amino Non-Esensial
Sebelas asam amino sisanya dapat disintesis oleh tubuh manusia. Mereka dihasilkan dari zat antara metabolisme umum seperti asam alfa-keto, yang berasal dari glikolisis dan siklus asam sitrat.
Jalur Biosintetik
Transaminasi
Langkah pertama dalam sintesis banyak asam amino adalah transaminasi. Asam alfa-keto menerima gugus amino dari asam amino lain (biasanya glutamat), yang dikatalisis oleh aminotransferase. Reaksi ini mengubah asam keto menjadi asam amino.
Keluarga Asam Amino
Asam amino dikelompokkan ke dalam keluarga berdasarkan prekursor biosintetiknya: dari alfa-ketoglutarat muncullah glutamat, glutamin, prolin, dan arginin; dari oksaloasetat muncul aspartat, asparagin, metionin, treonin, dan lisin; dari piruvat datanglah alanin, valin, leusin, dan isoleusin; dari 3-fosfogliserat muncul serin, glisin, dan sistein; dari shikimate muncul fenilalanin, tirosin, dan triptofan; dan dari ribosa-5-fosfat muncul histidin.
Peraturan
Sintesis asam amino diatur secara ketat oleh penghambatan umpan balik. Produk akhir dari suatu jalur menghambat enzim pertama yang terikat, mencegah produksi berlebih. Hal ini memungkinkan sel untuk menyesuaikan produksi asam amino dengan kebutuhannya.
Analisis Asam Amino Praktis dengan HPLC
Siapkan sampel (misalnya plasma, sel lisat, atau media kultur) dengan melakukan deproteinisasi dengan asam trikloroasetat atau asam sulfosalisilat 10% dalam volume yang sama. Sentrifugasi pada 10.000 × g selama 10 menit dan kumpulkan supernatannya. Derivatisasi asam amino untuk deteksi: untuk derivatisasi pra-kolom, campurkan 10 µL sampel dengan 70 µL buffer borat (pH 8,8) dan 20 µL reagen o-phthaldialdehyde (OPA) yang mengandung asam 3-mercaptopropionic. Inkubasi tepat 2 menit pada suhu kamar, kemudian suntikkan 10 µL ke kolom C18 fase terbalik (4,6 × 150 mm, 5 µm) yang diseimbangkan dengan 40 mM buffer natrium fosfat (pH 7,8). Elusi dengan gradien asetonitril (0–60% selama 30 menit) pada 1 mL/menit. Deteksi asam amino turunan OPA dengan fluoresensi (eksitasi 340 nm, emisi 450 nm). Alternatifnya, pisahkan asam amino yang diremehkan dengan kromatografi penukar kation dengan deteksi ninhidrin pascakolom. Elektroforesis zona kapiler (CZE) memberikan pendekatan alternatif untuk analisis asam amino, memungkinkan pemisahan asam amino yang diderivatisasi dan diremehkan dengan efisiensi tinggi dan waktu analisis yang singkat — asam amino bereaksi dengan ninhidrin pada 130°C membentuk produk ungu (ungu Ruhemann) yang terdeteksi pada 570 nm, sedangkan prolin dan hidroksiprolin menghasilkan produk kuning pada 440 nm. Hitung setiap asam amino dengan membandingkan area puncak dengan campuran standar 20 asam amino pada konsentrasi yang diketahui. Untuk formulasi media kultur sel, pastikan semua asam amino esensial (histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin) terdapat pada 0,5–12 mM tergantung pada jenis sel. Glutamin biasanya ditambahkan pada 2–4 mM karena ketidakstabilannya dalam larutan — glutamat terdegradasi menjadi glutamat dan amonia pada suhu 37°C dengan waktu paruh ~5 hari.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam kultur sel CHO fed-batch untuk produksi antibodi monoklonal, analisis HPLC harian dari media bekas menunjukkan bahwa glutamin, asparagin, dan serin habis setelah hari ke 5. Pakan target yang mengandung ketiga asam amino ini ditambahkan pada hari ke 6, sehingga memperpanjang viabilitas kultur dari hari ke 10 hingga hari ke 14 dan meningkatkan titer antibodi sebesar 40%.
