Kloning Gateway

Kloning Gateway menggunakan sistem rekombinasi spesifik-situs dari bakteriofag lambda. Ini menghilangkan kebutuhan enzim restriksi dan DNA ligase dengan menggunakan sekuens rekombinasi yang dikenali oleh enzim spesifik.

Sistem bekerja dalam dua reaksi:

• Reaksi BP: Produk PCR yang diapit oleh situs attB berekombinasi dengan vektor donor (pDONR) yang mengandung situs attP. Campuran enzim BP clonase mengkatalisis reaksi, menghasilkan klon entri dengan insert yang diapit oleh situs attL.
• Reaksi LR: Klon entri berekombinasi dengan vektor tujuan yang mengandung situs attR. LR clonase mentransfer insert ke vektor tujuan, yang menyediakan elemen ekspresi yang sesuai (promotor, tag, penanda seleksi) untuk organisme target.

Kloning Gateway bersifat directional, mempertahankan kerangka baca, dan memungkinkan klon entri yang sama dipindahkan ke puluhan vektor tujuan (misalnya, untuk ekspresi di bakteri, sel mamalia, ragi, atau tanaman). Keterbatasan utama adalah ukuran situs rekombinasi (attB1 dan attB2 ~50 bp masing-masing), yang menambahkan asam amino ekstra pada protein yang diekspresikan kecuali dihilangkan dengan langkah pemotongan protease.

Kloning TOPO

Kloning TOPO menggunakan topoisomerase I dari virus Vaccinia, yang memotong DNA dan tetap terikat secara kovalen pada fosfat 3’. Vektor TOPO yang dilinearisasi memiliki topoisomerase yang terikat pada kedua ujungnya. Ketika produk PCR dengan ujung yang kompatibel ditambahkan, topoisomerase mereligasi vektor, menyisipkan produk PCR — tanpa ligase.

TOPO TA cloning: Polimerase Taq menambahkan overhang 3’-A tunggal pada produk PCR. Vektor TOPO memiliki overhang 3’-T komplementer. Produk PCR dicampur dengan vektor terlinearisasi pada suhu ruang selama 5 menit, kemudian ditransformasikan ke dalam sel kompeten. Ini adalah metode kloning paling sederhana yang tersedia, tanpa digesti restriksi, ligasi, atau pemurnian pasca-PCR.

TOPO blunt-end cloning: Produk PCR dengan ujung tumpul (dari polimerase proofreading) diklon menggunakan versi vektor TOPO yang dioptimalkan untuk ligasi ujung tumpul. Efisiensinya sebanding dengan kloning TA dengan vektor yang tepat.

Memilih Di Antara Keduanya

Kloning TOPO lebih cepat (5 menit pada suhu ruang) dan lebih cocok untuk subkloning cepat satu insert. Gateway memerlukan lebih banyak persiapan (adaptor attB pada primer PCR, vektor entri dan tujuan terpisah) namun dapat diskalakan untuk aplikasi throughput tinggi dan membuat perpindahan antar sistem ekspresi menjadi trivial.