Spektrofotometer adalah instrumen paling umum di laboratorium manapun. Alat ini mengukur seberapa banyak cahaya yang diserap sampel pada panjang gelombang tertentu, yang sebanding dengan konsentrasi spesies penyerap.

Hukum Beer–Lambert

Hubungan fundamentalnya adalah:

A = ε × b × c

dengan A adalah absorbansi (tanpa satuan), ε adalah absorptivitas molar (L·mol⁻¹·cm⁻¹), b adalah panjang jalur (cm), dan c adalah konsentrasi (mol/L). Hukum ini berlaku untuk larutan encer (biasanya A < 1,5). Pada konsentrasi yang lebih tinggi, penyimpangan terjadi karena interaksi molekuler dan cahaya stray instrumen.

Komponen Instrumen

• Sumber cahaya: lampu deuterium untuk UV (190–350 nm), lampu tungsten-halogen untuk cahaya tampak (350–900 nm). Lampu kilat Xenon digunakan pada beberapa instrumen modern.
• Monokromator: kisi atau prisma yang memilih pita sempit panjang gelombang. Lebar pita mempengaruhi kualitas pengukuran — lebar pita yang lebih sempit memberikan linearitas yang lebih baik.
• Kompartemen sampel: menampung kuvet. Sebagian besar instrumen menerima kuvet dengan panjang jalur 1 cm. Kuvet terbuat dari kuarsa (untuk UV) atau kaca/plastik (hanya untuk cahaya tampak).
• Detektor: tabung fotomultiplier atau fotodioda yang mengubah cahaya yang ditransmisikan menjadi sinyal listrik.

Langkah Pengoperasian

1. Nyalakan instrumen dan biarkan sumber cahaya memanas (15–30 menit untuk lampu deuterium).
2. Pilih panjang gelombang pengukuran.
3. Isi kuvet dengan larutan blanko (pelarut tanpa analit).
4. Tempatkan blanko dalam penahan sampel dan atur absorbansi ke nol (autozero).
5. Ukur sampel dan catat absorbansinya.
6. Untuk beberapa sampel, nolkan ulang dengan blanko secara berkala.

Penanganan Kuvet

Pegang kuvet pada sisi buram atau bergaris — sidik jari pada jendela optik menghamburkan cahaya dan meningkatkan absorbansi. Bilas kuvet dengan larutan sampel sebelum mengisi. Pastikan tidak ada gelembung di jalur cahaya.

Aplikasi Umum

• Kuantifikasi asam nukleat: pengukuran A₂₆₀ (1 OD₂₆₀ ≈ 50 µg/mL dsDNA, 40 µg/mL RNA, 33 µg/mL ssDNA). Kemurnian dinilai dari rasio A₂₆₀/A₂₈₀ (≈1,8 untuk DNA murni, ≈2,0 untuk RNA murni).
• Kuantifikasi protein: uji Bradford, BCA, dan Lowry semuanya menggunakan spektrofotometri cahaya tampak.
• Kinematika enzim: pemantauan berkelanjutan konsumsi NADH pada 340 nm atau pembentukan produk pada panjang gelombang tertentu.
• Kurva pertumbuhan bakteri: kekeruhan diukur pada 600 nm (OD₆₀₀).
• Uji kimia kolorimetri: hampir semua analit dapat diukur jika bereaksi membentuk produk berwarna.