分光光度计是任何实验室中最常见的仪器。它测量样品在特定波长下吸收的光量，该光量与吸光物质的浓度成正比。

Beer–Lambert 定律

基本关系为：

A = ε × b × c

其中 A 为吸光度（无单位），ε 为摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹），b 为光程（cm），c 为浓度（mol/L）。该定律适用于稀溶液（通常 A < 1.5）。在较高浓度下，由于分子相互作用和仪器杂散光会产生偏差。

仪器组成

• 光源：紫外光（190–350 nm）用氘灯，可见光（350–900 nm）用钨卤素灯。一些现代仪器使用氙闪光灯。
• 单色仪：选择窄波段波长的光栅或棱镜。带宽影响测量质量——更窄的带宽提供更好的线性。
• 样品室：放置比色皿。大多数仪器使用 1 cm 光程的比色皿。比色皿为石英（用于紫外）或玻璃/塑料（仅用于可见光）。
• 检测器：将透射光转换为电信号的光电倍增管或光电二极管。

操作步骤

1. 打开仪器，让光源预热（氘灯需要 15–30 分钟）。
2. 选择测量波长。
3. 在比色皿中装入空白溶液（不含分析物的溶剂）。
4. 将空白放入样品架，将吸光度调零。
5. 测量样品并记录吸光度。
6. 对于多个样品，定期用空白重新调零。

比色皿操作

拿比色皿时握住磨砂面或棱纹面——光学窗口上的指纹会散射光并增加吸光度。在装样前用样品溶液润洗比色皿。确保光路中没有气泡。

常见应用

• 核酸定量：A₂₆₀ 测量（1 OD₂₆₀ ≈ 50 µg/mL 双链 DNA、40 µg/mL RNA、33 µg/mL 单链 DNA）。通过 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值评估纯度（纯 DNA 约 1.8，纯 RNA 约 2.0）。
• 蛋白质定量：Bradford、BCA 和 Lowry 检测均使用可见分光光度法。
• 酶动力学：连续监测 340 nm 处 NADH 的消耗或特定波长处产物的生成。
• 细菌生长曲线：在 600 nm 处测量浊度（OD₆₀₀）。
• 比色化学检测：几乎任何分析物只要能反应生成有色产物都可以测量。