Ikhtisar
Penyambungan alternatif adalah mekanisme mendasar di mana satu gen dapat menghasilkan banyak isoform mRNA, sehingga sangat memperluas kapasitas pengkodean genom. Hampir 95% gen multi-ekson manusia mengalami penyambungan alternatif, menghasilkan produk protein berbeda yang dapat memiliki fungsi berbeda, bahkan berlawanan. Pilihan ekson mana yang dimasukkan atau dikecualikan diatur secara ketat dan spesifik untuk jaringan. Analisis penyambungan alternatif bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengukur perbedaan tingkat isoform di seluruh kondisi, tahap perkembangan, atau kondisi penyakit, sehingga mengungkap lapisan tambahan regulasi gen di luar perubahan ekspresi sederhana.
Metode
Deteksi peristiwa penyambungan alternatif dari data RNA-seq memerlukan pendekatan komputasi khusus. Alat kuantifikasi isoform (seperti Salmon, Kallisto, atau RSEM) memperkirakan kelimpahan setiap transkrip isoform yang diketahui. Alat berbasis peristiwa (rMATS, MAJIQ, atau SUPPA2) mengklasifikasikan peristiwa penyambungan ke dalam kategori: lompatan ekson kaset, ekson saling eksklusif, lokasi sambungan alternatif 5’ atau 3’, dan retensi intron. Alat-alat ini menggunakan matriks hitungan pemetaan baca untuk menyambung persimpangan versus ekson dan menguji perbedaan signifikan menggunakan model statistik berpasangan. De novo splice deteksi (oleh StringTie atau Cufflinks) menyusun transkrip tanpa anotasi untuk menemukan isoform baru. Memvisualisasikan perbedaan penyambungan dengan plot sashimi (dari MISO atau IGV) membantu menafsirkan pola yang kompleks.
Aplikasi
Disregulasi penyambungan alternatif adalah ciri dari banyak penyakit. Pada kanker, faktor penyambungan sering kali bermutasi, menghasilkan isoform spesifik tumor yang mendorong proliferasi dan metastasis. Gangguan neurologis seperti atrofi otot tulang belakang dan demensia frontotemporal diakibatkan langsung oleh cacat penyambungan. Memahami pola penyambungan membantu interpretasi struktur dan jenis RNA dan didasarkan pada konsep dari transkripsi dan pemrosesan RNA. Analisis penyambungan juga bersinggungan dengan regulasi gen dan epigenetika, karena keadaan kromatin memengaruhi pemilihan lokasi penyambungan kotranskripsional, dan umpan balik penyambungan dapat mengatur pemanjangan transkripsi.
Protokol Praktis
Untuk penyambungan diferensial berbasis peristiwa dengan rMATS, mulailah dengan file BAM RNA-seq yang disejajarkan dengan STAR menggunakan tanda --outSAMstrandField intronMotif untuk penyelarasan sadar sambungan. Siapkan file daftar BAM dan anotasi GTF, lalu jalankan rmats.py --b1 sample1.bam,sample2.bam --b2 control1.bam,control2.bam --gtf annotation.gtf --od output_dir -t pair --readLength 150. rMATS mendeteksi lima jenis peristiwa penyambungan: ekson yang dilewati (SE), ekson saling eksklusif (MXE), situs sambungan 5’ alternatif (A5SS), situs sambungan 3’ alternatif (A3SS), dan intron tertahan (RI). Hasil mencakup perbedaan tingkat inklusi (IncLevelDifference) dan tingkat penemuan palsu (FDR) untuk setiap peristiwa. Metrik utamanya adalah nilai Persen Spliced In (PSI atau Ψ), yang mengukur proporsi transkrip yang menyertakan ekson. PSI berkisar dari 0 (tidak termasuk) hingga 1 (termasuk), dan ΔΨ > 0,1 dengan FDR < 0,05 merupakan ambang batas signifikansi yang umum. Untuk kuantifikasi tingkat isoform tanpa klasifikasi peristiwa, Salmon dalam mode bebas penyelarasan menghitung kelimpahan transkrip: salmon quant -i transkriptome_index -l A -1 R1.fastq -2 R2.fastq -o isoform_output. Di hilir, tximport mengimpor perkiraan tingkat transkrip ke R, dan pengujian DRIMSeq atau satuRn untuk penggunaan transkrip diferensial. Visualisasikan peristiwa penyambungan dengan rmats2sashimiplot, yang menghasilkan plot sashimi yang menunjukkan cakupan baca di persimpangan ekson-ekson. Integrasikan analisis splicing QTL (sQTL) menggunakan FastQTL ketika data genotipe tersedia, menghubungkan varian genetik dengan variasi splicing antar individu.
