Apoptosis adalah proses kematian sel yang teratur dan bergantung energi yang ditandai oleh perubahan biokimia dan morfologi yang khas. Tidak ada satu uji pun yang menangkap semua aspek, sebagian besar eksperimen menggunakan kombinasi metode yang menargetkan ciri yang berbeda.
Uji Aktivitas Kaspase
Kaspase adalah protease sistein-aspartat yang menjalankan program apoptosis. Kaspase-3 dan -7 adalah kaspase eksekutor utama.
Substrat fluorogenik: sekuens peptida pengenal (DEVD untuk kaspase-3/7) yang dihubungkan ke fluorofor (AMC, AFC). Kaspase aktif membelah peptida, membebaskan fluorofor. Fluoresensi (eks/em 355/460 nm untuk AMC) diukur dalam pembaca plat. Uji ini sederhana, kuantitatif, dan cocok untuk skrining throughput tinggi.
Reporter FRET: sel yang mengekspresikan peptida DEVD yang diapit oleh pasangan protein fluoresen (misalnya, CFP–DEVD–YFP) beralih dari FRET ke emisi donor setelah pembelahan kaspase. Reporter ini memungkinkan pemantauan apoptosis waktu-nyata dalam sel hidup melalui mikroskop atau sitometri alir.
Anneksin V / Propidium Iodida
Pada apoptosis awal, fosfatidilserin (PS) ditranslokasi dari daun dalam ke daun luar membran plasma. Anneksin V mengikat PS dengan afinitas tinggi secara dependen Ca²⁺. Dikonjugasi ke FITC, PE, atau APC, ia memberi label sel apoptosis awal.
Propidium iodida (PI) adalah pewarna DNA yang tidak permeabel membran yang masuk hanya ketika membran sel terganggu (apoptosis akhir atau nekrosis). Pewarnaan ganda membedakan:
- Viabel: Anneksin V⁻/PI⁻
- Apoptosis awal: Anneksin V⁺/PI⁻
- Apoptosis akhir: Anneksin V⁺/PI⁺
- Nekrotik: Anneksin V⁻/PI⁺
Analisis dilakukan dengan sitometri alir atau mikroskop fluoresensi. Uji harus dilakukan dalam 30 menit setelah penambahan PI, karena PI bocor dari sel seiring waktu.
Fragmentasi DNA
Selama apoptosis, endonuklease (CAD/DFF40) membelah DNA di antara nukleosom, menghasilkan fragmen dalam kelipatan 180–200 bp.
Tangga DNA: DNA genomik diekstraksi, dipisahkan pada gel agarosa, dan diwarnai dengan etidium bromida. Sel apoptosis menunjukkan pola tangga karakteristik fragmen 180 bp. Ini adalah uji kualitatif titik akhir dan relatif tidak sensitif, memerlukan ~10⁶ sel.
TUNEL: TdT menggabungkan dUTP yang diberi label pada ujung 3’-OH dari DNA yang terfragmentasi. Label (biotin, DIG, atau fluorofor) dideteksi dengan mikroskop atau sitometri alir. TUNEL memberi label semua pemutusan DNA, termasuk yang ada di sel nekrotik, sehingga paling baik dikombinasikan dengan diskriminasi berbasis morfologi.
Potensial Membran Mitokondria
Hilangnya potensial membran mitokondria (ΔΨₘ) adalah ciri jalur apoptosis intrinsik. Fluorofor yang terakumulasi di mitokondria berdasarkan potensial membran digunakan:
- JC-1: memancarkan hijau (monomer) pada ΔΨₘ rendah dan merah (agregat J) pada ΔΨₘ tinggi. Rasio merah/hijau menunjukkan polarisasi mitokondria.
- TMRE / TMRM: pewarna bermuatan positif yang terakumulasi di mitokondria terpolarisasi. Hilangnya fluoresensi merah menunjukkan depolarisasi.
Kontrol yang Tepat
Semua uji apoptosis memerlukan kontrol positif (misalnya, 1 µM staurosporin selama 4–6 jam) dan negatif (tanpa perlakuan). Waktu uji penting: aktivitas kaspase mencapai puncak pada 4–8 jam, paparan PS pada 6–12 jam, dan fragmentasi DNA pada 12–24 jam setelah stimulus apoptosis.
