Uji Apoptosis
Apoptosis (kematian sel terprogram) ditandai dengan perubahan morfologi dan biokimia tertentu. Beberapa uji komplementer membedakan apoptosis dari nekrosis dan mengidentifikasi tahap kematian sel.
Pewarnaan Annexin V / Propidium Iodida adalah uji apoptosis berbasis flow cytometry yang paling umum. Selama apoptosis awal, fosfatidilserin (PS) ditranslokasi dari daun dalam ke daun luar membran plasma. Annexin V, protein pengikat PS yang dikonjugasi dengan fluorofor (FITC, APC, PE), berikatan dengan PS yang terekspos. Propidium iodida (PI) atau 7-AAD hanya masuk ke sel dengan membran yang rusak (apoptosis lanjut/nekrosis).
- Annexin V⁻ / PI⁻: sel hidup
- Annexin V⁺ / PI⁻: sel apoptosis awal
- Annexin V⁺ / PI⁺: sel apoptosis lanjut / nekrotik
Uji TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) mendeteksi fragmentasi DNA, ciri khas apoptosis lanjut. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) menambahkan dUTP berlabel ke ujung 3′-OH DNA yang terfragmentasi. Deteksi dilakukan dengan mikroskopi fluoresensi atau flow cytometry.
Uji Caspase mengukur aktivitas caspase, protease eksekutor apoptosis. Substrat fluorogenik (misalnya, DEVD-AMC untuk caspase-3/7) dibelah oleh caspase aktif, melepaskan sinyal fluoresen. Aktivitas caspase-3/7 adalah penanda biokimia apoptosis yang paling banyak digunakan.
Analisis Siklus Sel
Analisis siklus sel mengukur distribusi sel di seluruh fase G₀/G₁, S, G₂, dan M, mengungkapkan efek obat, nutrisi, atau perubahan genetik pada pembelahan sel.
Analisis konten DNA dengan flow cytometry menggunakan pewarna pengikat DNA fluoresen (PI, DAPI, Hoechst 33342). Sel yang difiksasi dan dipermeabilisasi diwarnai, dan intensitas fluoresensi diukur. Intensitas sebanding dengan konten DNA:
- G₀/G₁: konten DNA 2N (satu puncak)
- S: antara 2N dan 4N (daerah di antara puncak)
- G₂/M: konten DNA 4N (puncak kedua)
Persentase sel di setiap fase dihitung menggunakan perangkat lunak pemodelan (ModFit, algoritma Watson FlowJo).
Pulse-chase BrdU/EdU memberikan informasi siklus sel yang lebih rinci. Pulse pendek BrdU atau EdU memberi label pada sel dalam fase-S. Setelah periode chase, sel dianalisis untuk konten DNA dan inkorporasi BrdU/EdU, mengungkapkan laju progresi fase-S dan durasi setiap fase.
Pewarnaan Phospho-histone H3 (Ser10) secara khusus menandai sel mitosis, menyediakan penanda fase G₂/M yang membedakan G₂ dari M dengan flow cytometry atau mikroskopi.
