ATAC-Seq adalah metode untuk mengidentifikasi daerah kromatin terbuka, area genom di mana DNA tidak melilit erat di sekitar nukleosom dan dapat diakses oleh faktor transkripsi dan protein regulator lainnya.

Prinsip

Turunan hiperaktif dari transposase Tn5 (kompleks transposom Tn5) secara simultan memfragmentasi dan memberi tag DNA yang dapat diakses dengan adapter sekuensing dalam proses yang disebut tagmentasi. Daerah kromatin terbuka lebih dipotong dan ditandai oleh Tn5 karena DNA yang terikat nukleosom secara fisik tidak dapat diakses. Fragmen yang diberi tag kemudian diamplifikasi PCR dan disekuensing.

Protokol

1. Panen 50.000 sel viabel (minimum yang direkomendasikan). Untuk eksperimen input rendah, sebanyak 500 sel dapat digunakan.
2. Lisis sel dalam buffer lisis dingin (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 0,1% IGEPAL CA-630) selama 10 menit di atas es untuk mengisolasi nukleus utuh.
3. Pelet nukleus dan resuspensi dalam campuran reaksi transposisi yang mengandung transposom Tn5 yang dimuati dengan adapter kompatibel Illumina.
4. Inkubasi pada 37 °C selama 30 menit dengan pencampuran lembut.
5. Murnikan DNA yang telah ditagmentasi menggunakan pemurnian berbasis kolom atau manik.
6. PCR-amplifikasi selama 10–15 siklus, menggabungkan indeks barcoding.
7. Sekuensing pada platform Illumina (paired-end 50 bp adalah standar).

Analisis Data

Bacaan mentah:

1. Dipotong dari sekuens adapter dan disejajarkan ke genom referensi.
2. Disaring untuk menghilangkan bacaan mitokondria (yang dapat terdiri dari 30–50% bacaan).
3. Dikoreksi untuk bias insersi Tn5 (Tn5 memiliki preferensi sekuens lemah untuk dinukleotida tertentu).
4. Dipanggil puncak kromatin terbuka menggunakan MACS2 atau Genrich.
5. Dianotasi untuk mengidentifikasi puncak di promotor, enhancer, situs pengikatan CTCF, dan elemen regulator lainnya.

Puncak yang dihasilkan mendefinisikan lanskap kromatin yang dapat diakses. Aksesibilitas diferensial antar kondisi mengidentifikasi elemen regulator yang mengubah aktivitas selama diferensiasi, perkembangan penyakit, atau perlakuan obat.

Kontrol Kualitas

• Distribusi ukuran fragmen: Tn5 menghasilkan fragmen dua ukuran. Fragmen bebas nukleosom adalah <100 bp, fragmen mononukleosomal adalah 180–247 bp, dan fragmen dinukleosomal adalah 315–400 bp. Pustaka ATAC-Seq yang baik menunjukkan pola tangga nukleosom yang jelas.
• Fraksi bacaan dalam puncak (FRiP): skor FRiP >0,3 menunjukkan rasio signal-to-noise yang baik.
• Pengayaan situs awal transkripsi (TSS): bacaan harus diperkaya di TSS. Skor pengayaan TSS >5 menunjukkan kualitas baik.

Aplikasi

ATAC-Seq digunakan untuk mengidentifikasi elemen regulator (promotor, enhancer, silencer), mempelajari footprinting faktor transkripsi, dan memprofilkan dinamika kromatin antar status dan jenis sel. ATAC-Seq sel tunggal (scATAC-Seq) memperluas metode ke sel individu, mengungkap lanskap regulator spesifik jenis sel dalam jaringan heterogen.

Perbandingan dengan DNase-Seq dan MNase-Seq

ATAC-Seq memerlukan 10–100× lebih sedikit sel daripada DNase-Seq (50.000 vs. 10–50 juta), memakan waktu 1–2 hari bukan 3–4 hari, dan memiliki alur kerja yang lebih sederhana (satu enzim bukan titrasi DNase I). MNase-Seq memetakan posisi nukleosom (bukan kromatin terbuka) dan memerlukan 10–50 juta sel. ATAC-Seq telah menggantikan kedua metode untuk profiling aksesibilitas kromatin rutin.