Setelah mengisolasi kultur murni, langkah berikutnya adalah identifikasi. Uji biokimia tradisional menilai kemampuan metabolik, sementara sistem otomatis modern mempercepat dan menstandarisasi proses.

Uji Biokimia Inti

• Katalase: mendeteksi enzim katalase, yang memecah hidrogen peroksida. Setetes H₂O₂ 3% pada koloni menghasilkan gelembung (positif) dalam hitungan detik. Stafilokokus positif katalase; streptokokus negatif katalase.
• Oksidase: mendeteksi sitokrom c oksidase. Koloni yang dioleskan pada kertas saring yang diresapi reagen oksidase (tetrametil-p-fenilendiamin) berubah menjadi ungu gelap dalam 10–30 detik (positif). Neisseria dan Pseudomonas positif oksidase; Enterobacteriaceae negatif oksidase.
• Koagulase: membedakan Staphylococcus aureus (positif) dari stafilokokus lainnya. Koagulase bebas dideteksi dengan mencampur koloni dengan plasma kelinci dan memeriksa pembentukan bekuan pada 4–24 jam.
• Indole: beberapa bakteri (E. coli antara lain) menghasilkan indole dari triptofan. Indole bereaksi dengan reagen Kovac’s (p-dimetilaminobenzaldehida) menghasilkan lapisan merah.
• Methyl red / Voges–Proskauer (MR/VP): MR mendeteksi fermentasi asam campuran (merah dengan indikator methyl red). VP mendeteksi jalur fermentasi butanediol (merah muda/merah dengan α-naftol dan KOH). Klasik untuk E. coli (MR⁺, VP⁻) vs. Enterobacter / Klebsiella (MR⁻, VP⁺).
• Penggunaan sitrat: bakteri yang menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon menghasilkan amonia, menaikkan pH dan mengubah bromotimol biru dari hijau menjadi biru. Klebsiella pneumoniae positif; E. coli negatif.
• Agar TSI (Triple Sugar Iron): agar miring yang mendeteksi fermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa, produksi gas, dan produksi H₂S. Pola reaksi asam/alkali dan endapan hitam khas untuk bakteri enterik.

Sistem Miniatur (Strip API)

Sistem API (Analytical Profile Index) meminiaturkan 20–50 uji biokimia dalam strip plastik. Setiap uji adalah substrat dehidrasi dalam cupule. Strip diinokulasi dengan suspensi bakteri standar, diinkubasi selama 18–24 jam, dan reaksi dibaca berdasarkan perubahan warna. Nomor profil 7 atau 9 digit yang dihasilkan dicari dalam database untuk mengidentifikasi organisme.

Sistem Otomatis

• VITEK (bioMérieux): menggunakan kartu plastik yang mengandung 30–60 reaksi biokimia. Suspensi bakteri dimuat ke dalam kartu, yang disegel dan dibaca secara otomatis setiap 15 menit. Identifikasi dihasilkan dalam 2–8 jam. VITEK 2 juga menyediakan uji kerentanan antimikroba (AST).
• MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry): metode identifikasi tercepat yang tersedia. Koloni bakteri ditempatkan pada plat target, dilapisi dengan matriks (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid), dan dianalisis dengan spektrometri massa. Spektrum protein yang dihasilkan (terutama protein ribosom) dibandingkan dengan database, memberikan identifikasi tingkat spesies dalam waktu kurang dari satu menit per sampel.

MALDI-TOF telah menggantikan uji biokimia di laboratorium mikrobiologi klinis karena kecepatan, akurasi, dan biaya habis pakai yang rendah setelah akuisisi instrumen. Ini mengidentifikasi bakteri, ragi, dan jamur dari satu koloni tanpa memerlukan pengetahuan sebelumnya tentang organisme.