Pewarnaan Gram membedakan bakteri berdasarkan struktur dinding sel, tetapi banyak fitur bakteri memerlukan metode pewarnaan khusus untuk visualisasi mikroskopis.

Pewarnaan Endospora (Schaeffer–Fulton)

Endospora bakteri (Bacillus, Clostridium) adalah struktur dorman yang sangat resisten yang tidak diwarnai dengan pewarnaan sederhana atau Gram. Metode Schaeffer–Fulton menggunakan malachite green, yang didorong ke dalam spora oleh panas (pengukusan), dan safranin sebagai counterstain.

1. Rendam apusan dengan malachite green 5% (b/v) dan kukus selama 5 menit (jaga agar kaca objek tetap lembab dengan menambahkan lebih banyak pewarna).
2. Dinginkan dan bilas dengan air (malachite green terperangkap di dalam spora tetapi tercuci dari sel vegetatif).
3. Counterstain dengan safranin 0,5% selama 30 detik.
4. Bilas, keringkan, dan periksa.

Spora muncul hijau (sering sebagai badan oval atau bulat di dalam atau dilepaskan dari sel vegetatif merah muda/merah). Posisi spora (terminal, subterminal, sentral) adalah fitur identifikasi utama.

Pewarnaan Kapsul

Kapsul adalah lapisan polisakarida atau polipeptida yang mengelilingi beberapa bakteri, melindunginya dari fagositosis dan kekeringan. Kapsul larut dalam air dan mudah terganggu oleh fiksasi panas.

Metode Anthony: apusan dikeringkan udara (tidak difiksasi panas!), diwarnai dengan crystal violet 1% selama 2 menit, lalu dicuci dengan tembaga sulfat 20%. Tembaga sulfat bertindak sebagai dekoloriser dan mordan. Kapsul muncul sebagai lingkaran cahaya ungu pucat di sekitar sel ungu gelap dengan latar belakang terang.

Pewarnaan negatif tinta India: campur suspensi bakteri dengan tinta India, sebarkan tipis, dan keringkan udara. Partikel tinta tidak dapat menembus kapsul, meninggalkan lingkaran cahaya jernih di sekitar sel dengan latar belakang gelap. Eosin atau nigrosin dapat digunakan sebagai pengganti tinta India.

Pewarnaan Flagela

Flagela bakteri setebal 10–20 nm — di bawah resolusi mikroskop cahaya. Pewarnaan flagela menggunakan mordan (asam tanat) untuk melapisi dan menebalkan flagela, diikuti dengan pewarnaan perak atau pewarna pararosanilin.

1. Gunakan kultur muda (fase log) yang ditumbuhkan pada media padat.
2. Siapkan apusan tipis yang dikeringkan udara — jangan fiksasi panas.
3. Terapkan mordan (misalnya, pewarna Leifson: asam tanat, basic fuchsin, natrium klorida) dan inkubasi.
4. Flagela muncul sebagai benang tipis bergelombang yang memanjang dari badan sel.

Susunan flagela (polar, peritrichous, lophotrichous) adalah karakteristik taksonomi yang penting.

Pewarnaan Tahan Asam (Ziehl–Neelsen)

Spesies Mycobacterium (tuberkulosis, kusta) memiliki dinding sel lilin yang kaya asam mikolat yang menolak pewarnaan Gram standar. Metode Ziehl–Neelsen menggunakan panas untuk mendorong carbolfuchsin melalui penghalang lilin:

1. Rendam apusan dengan carbolfuchsin dan kukus selama 5 menit.
2. Dekolorisasi dengan 3% HCl dalam etanol 95% (asam-alkohol) — bakteri tidak tahan asam kehilangan pewarna.
3. Counterstain dengan methylene blue selama 1 menit.

Bakteri tahan asam muncul merah terang dengan latar belakang biru. Metode Kinyoun menggunakan konsentrasi fenol yang lebih tinggi dan deterjen dalam carbolfuchsin, menghilangkan kebutuhan pemanasan. Pewarnaan auramine–rhodamine menggunakan pewarna fluoresen untuk sensitivitas yang lebih tinggi dalam skrining tuberkulosis.