Transformasi adalah pengambilan dan replikasi DNA asing oleh sel bakteri. Sebagian besar galur laboratorium Escherichia coli tidak kompeten secara alami — mereka harus diinduksi secara artifisial untuk mengambil DNA.

Persiapan Sel Kompeten

Sel kompeten kimiawi dibuat dengan mencuci E. coli fase log dengan CaCl₂ dingin (50–100 mM). Ion kalsium menetralkan tulang punggung fosfat DNA yang bermuatan negatif dan lapisan lipopolisakarida membran luar bakteri, memfasilitasi pengikatan DNA. Sel kemudian dialikuot dan dibekukan pada −80 °C.

Sel elektrokompeten dicuci berulang kali dalam gliserol 10% dingin untuk menghilangkan semua ion dari suspensi. Kekuatan ionik rendah mencegah percikan selama elektroporasi. Sel diresuspensi dalam volume kecil gliserol 10%, dialikuot, dan dibekukan.

Protokol Transformasi Kimiawi

1. Cairkan tabung sel kompeten kimiawi di atas es (sekitar 20 menit).
2. Tambahkan 1–10 µL DNA (0,1–100 ng plasmid, atau hingga 5 µL reaksi ligasi).
3. Inkubasi di atas es selama 20–30 menit.
4. Kejutan panas pada 42 °C tepat 45 detik — lebih lama mengurangi viabilitas.
5. Kembalikan ke es selama 2 menit.
6. Tambahkan 500–900 µL media SOC atau LB (tanpa antibiotik).
7. Inkubasi pada 37 °C dengan pengocokan 200–225 rpm selama 45–60 menit.
8. Sebarkan 50–200 µL pada plat agar selektif.
9. Inkubasi terbalik semalaman pada 37 °C.

Efisiensi tipikal: 10⁶–10⁸ CFU/µg untuk sel kompeten kimiawi.

Protokol Elektroporasi

1. Cairkan sel elektrokompeten di atas es.
2. Pindahkan sel ke kuvet dingin 0,1 atau 0,2 cm.
3. Tambahkan 1–2 µL DNA dalam buffer garam rendah atau air (garam menyebabkan percikan).
4. Elektroporasi pada 1,5–2,5 kV (tergantung celah kuvet), 200–400 Ω, 25 µF.
5. Segera tambahkan 500 µL media SOC dan resuspensi.
6. Pindahkan ke tabung kultur dan inkubasi pada 37 °C selama 45–60 menit.
7. Sebarkan pada agar selektif.

Efisiensi tipikal: 10⁹–10¹⁰ CFU/µg untuk plasmid kecil. Elektroporasi lebih disukai untuk konstruk besar (>10 kb) dan produk ligasi.

Seleksi

Sel yang ditransformasi diseleksi pada agar yang mengandung antibiotik yang sesuai dengan penanda resistensi pada plasmid. Antibiotik umum: ampisilin (100 µg/mL), kanamisin (50 µg/mL), kloramfenikol (25 µg/mL), tetrasiklin (12,5 µg/mL). Seleksi ampisilin memerlukan plat segar karena β-laktamase berdifusi dan mendegradasi antibiotik — koloni satelit muncul pada plat lama.