Metilasi DNA pada dinukleotida CpG adalah modifikasi epigenetik yang paling baik dikarakterisasi. Konversi bisulfit yang dikombinasikan dengan sekuensing memberikan pembacaan kuantitatif seluruh genom dari marka ini.
Kimia Bisulfit
Perlakuan DNA genomik dengan natrium bisulfit (NaHSO₃) pada pH rendah (pH 5,0, 50–70 °C, 4–16 jam) mendeaminasi sitosin yang tidak termetilasi menjadi urasil, sementara 5-metilsitosin (5mC) dan 5-hidroksimetilsitosin (5hmC) resisten terhadap deaminasi. Setelah amplifikasi PCR, urasil dibaca sebagai timin dan 5mC dibaca sebagai sitosin.
Tingkat konversi harus >99% agar dapat diandalkan. DNA fag lambda yang tidak terkonversi sering digunakan sebagai spike-in untuk mengukur efisiensi konversi.
Metode
Sekuensing bisulfit seluruh genom (WGBS): sekuensing seluruh genom setelah konversi bisulfit. Ini adalah standar emas untuk analisis metilasi komprehensif pada resolusi basa tunggal di seluruh genom. Biaya komputasi tinggi: cakupan 30× memerlukan ~900 juta bacaan untuk genom manusia. Karena DNA yang telah dikonversi bisulfit sebagian besar adalah C→T (dan G→A pada untai komplementer), penjajaran memerlukan indeks genom tiga huruf khusus (C→T dikonversi pada kedua untai).
Sekuensing bisulfit representasi tereduksi (RRBS): DNA genomik pertama-tama dicerna dengan enzim restriksi yang tidak sensitif terhadap metilasi (MspI, C↓CGG), yang memotong di daerah kaya CpG. Fragmen dipilih berdasarkan ukuran (40–220 bp), dikonversi bisulfit, dan disekuensing. RRBS memperkaya pulau CpG, promotor, dan daerah regulasi lainnya pada ~10–20% biaya WGBS.
Sekuensing bisulfit tertarget: Primer PCR dirancang untuk memperkuat daerah spesifik yang diminati dari DNA yang telah dikonversi bisulfit. Produk PCR disekuensing Sanger atau NGS. Panel multipleks tertarget yang mencakup ratusan daerah tersedia secara komersial. Pendekatan ini hemat biaya untuk proyek yang berfokus pada panel gen tertentu.
Pyrosequencing: Metode sekuensing kuantitatif waktu nyata untuk amplikon pendek (100–200 bp) dari DNA yang telah dikonversi bisulfit. Tinggi puncak pada setiap posisi C mencerminkan rasio C (termethylasi) terhadap T (tidak termethylasi), memberikan persentase metilasi kuantitatif pada setiap situs CpG. Pyrosequencing adalah standar emas untuk validasi marka metilasi yang diidentifikasi oleh array atau NGS.
Analisis Data
Metilasi pada setiap CpG dilaporkan sebagai nilai β: β = M / (M + U + 100), di mana M adalah bacaan termetilasi dan U adalah bacaan tidak termetilasi. Nilai β berkisar dari 0 (sepenuhnya tidak termetilasi) hingga 1 (sepenuhnya termetilasi).
Analisis metilasi diferensial mengidentifikasi posisi (DMP) dan daerah (DMR) yang termetilasi secara diferensial antar kondisi. Sebagian besar metode menggunakan model beta-binomial untuk memperhitungkan cakupan yang bervariasi di seluruh situs CpG.
Membedakan 5mC dari 5hmC
Sekuensing bisulfit standar tidak dapat membedakan 5-metilsitosin dari 5-hidroksimetilsitosin, keduanya dilindungi dari deaminasi. Untuk mendeteksi 5hmC secara spesifik, diperlukan metode tambahan:
- TAB-Seq: T4-β-glukosiltransferase melindungi 5hmC dengan glukosa, kemudian TET1 mengoksidasi 5mC menjadi 5caC, yang kemudian dikonversi menjadi urasil oleh bisulfit. Hanya 5hmC yang terbaca sebagai C.
- oxBS-Seq: Kalium perutenat (KRuO₄) mengoksidasi 5hmC menjadi 5fC, yang dikonversi menjadi urasil oleh bisulfit. 5mC tetap sebagai C. Membandingkan oxBS-Seq dengan BS-Seq standar memberikan kadar 5hmC melalui pengurangan.
