Elektroforesis gel kapiler (CGE) adalah mode elektroforesis kapiler di mana kapiler pemisah diisi dengan gel polimer atau larutan polimer linier yang berfungsi sebagai medium penyaring. Molekul yang bermigrasi melalui matriks diperlambat berdasarkan ukurannya — spesies yang lebih kecil menavigasi jaringan polimer lebih cepat, sementara spesies yang lebih besar semakin terhambat. CGE mencapai resolusi basa tunggal untuk fragmen DNA hingga sekitar 500 basa dan merupakan teknologi pemisahan inti dalam sekuensing DNA modern dan pembuatan profil DNA forensik. CGE juga banyak digunakan untuk penentuan ukuran protein dan analisis kemurnian dalam kondisi denaturasi (SDS-CGE), menyediakan alternatif otomatis dan kuantitatif terhadap SDS-PAGE gel lempeng klasik.
Matriks Penyaring
Matriks penyaring dalam CGE menggantikan gel lempeng yang digunakan dalam elektroforesis konvensional. Metode CGE awal menggunakan gel poliakrilamida berikatan silang yang dipolimerisasi di dalam kapiler, tetapi gel ini sulit diganti saat kotor dan memiliki stabilitas terbatas di bawah medan listrik tinggi. CGE modern sebagian besar menggunakan larutan polimer linier yang dapat diganti, biasanya poliakrilamida linier (LPA), poli(etilena oksida) (PEO), atau turunan pullulan. Polimer-polimer ini dilarutkan dalam buffer pemisah pada konsentrasi yang menciptakan jaringan yang saling terikat dengan ukuran pori yang ditentukan oleh panjang rantai polimer dan konsentrasi. Setelah setiap analisis, larutan polimer dikeluarkan dari kapiler dan diganti dengan matriks segar, menghilangkan efek bawaan dan memungkinkan ratusan analisis berurutan. Pilihan jenis dan konsentrasi polimer menentukan rentang penyaringan efektif — LPA konsentrasi rendah (2–4%) memisahkan fragmen DNA besar hingga 20 kb, sementara konsentrasi yang lebih tinggi (5–7%) memberikan resolusi basa tunggal yang diperlukan untuk sekuensing DNA hingga 600–1000 basa.
Prinsip Pemisahan
Dalam CGE, pemisahan hanya bergantung pada ukuran molekul dalam kondisi denaturasi yang menghilangkan struktur sekunder. Untuk analisis DNA, sampel didenaturasi dengan panas dan formamida, dan pemisahan dilakukan pada suhu tinggi (40–70°C) dengan adanya urea atau bahan denaturan lainnya. Dalam kondisi ini, fragmen DNA bermigrasi sebagai gulungan acak, dan mobilitas elektroforetiknya berbanding terbalik dengan logaritma berat molekulnya. Hubungan antara waktu migrasi dan panjang fragmen kira-kira linier dalam rentang ukuran yang ditentukan, memungkinkan penentuan ukuran yang akurat dengan perbandingan terhadap standar ukuran internal yang ditambahkan ke setiap sampel. Untuk analisis protein (SDS-CGE), protein didenaturasi dengan natrium dodesil sulfat (SDS) dan agen pereduksi seperti ditiotreitol (DTT) atau 2-merkaptoetanol. SDS mengikat protein pada rasio massa konstan sekitar 1,4 g SDS per gram protein, memberikan kerapatan muatan negatif yang seragam. Protein yang dilapisi SDS kemudian bermigrasi melalui matriks polimer secara ketat sesuai dengan berat molekulnya, dengan hubungan log-linier yang sama antara mobilitas dan massa yang mengatur SDS-PAGE.
Instrumentasi dan Operasi
Instrumen CGE berbagi komponen inti yang sama dengan sistem elektroforesis kapiler serba guna — catu daya tegangan tinggi, reservoir buffer, kapiler silika leburan, dan detektor — tetapi dioptimalkan untuk operasi dengan matriks polimer kental. Kapiler biasanya dilapisi secara internal untuk menekan aliran elektroosmotik dan mengurangi adsorpsi analit ke dinding silika. Pompa tekanan tinggi atau kartrid berbasis gas digunakan untuk mengisi kapiler dengan larutan polimer sebelum setiap analisis dan mengeluarkannya setelahnya. Introduksi sampel dilakukan dengan injeksi elektrokinetik, di mana tegangan diterapkan untuk mendorong analit bermuatan ke ujung kapiler. Mode injeksi ini secara inheren bias terhadap spesies yang lebih kecil dan lebih mobile tetapi memberikan sensitivitas yang diperlukan untuk analisis DNA dan protein tingkat jejak. Untuk operasi throughput tinggi, susunan multi-kapiler (96 atau 384 kapiler) digunakan secara paralel, memproses ratusan sampel per hari dalam aplikasi seperti pemeriksaan DNA forensik dan sekuensing klinis.
Metode Deteksi
Deteksi fluoresensi induksi laser (LIF) adalah metode deteksi dominan dalam CGE, menawarkan sensitivitas tingkat attomol hingga zeptomol yang diperlukan untuk sekuensing DNA dan analisis forensik. Fragmen DNA diberi label dengan pewarna interkalasi yang berpendar saat mengikat DNA untai ganda, atau dengan pewarna fluoresen yang terikat secara kovalen (misalnya, FAM, JOE, ROX) untuk resolusi basa tunggal dalam sekuensing. Deteksi LIF multi-warna, menggunakan beberapa laser dan filter emisi, memungkinkan beberapa pewarna dibedakan dalam satu analisis — deteksi empat warna adalah standar untuk sekuensing Sanger, dan sistem lima atau enam warna digunakan dalam analisis pengulangan tandem pendek (STR) forensik. Deteksi serapan UV adalah alternatif untuk analit yang tidak diberi label seperti protein dan polimer sintetis, meskipun sensitivitasnya dibatasi oleh panjang jalur optik kapiler yang pendek (biasanya 50–100 µm).
Aplikasi dalam Sekuensing DNA
CGE adalah mesin pemisah dari sekuensing DNA Sanger modern. Dalam alur kerja tipikal, reaksi sekuensing siklik menghasilkan campuran fragmen berlabel fluoresen yang berakhir pada setiap posisi nukleotida. Fragmen-fragmen ini diinjeksikan ke dalam kapiler CGE yang diisi dengan matriks penyaring LPA dan dipisahkan berdasarkan ukuran dalam kondisi denaturasi. Saat setiap fragmen melewati detektor LIF, warnanya mengidentifikasi basa terminal, dan instrumen merekam elektroferogram empat warna dari mana sekuens DNA ditentukan. Platform komersial seperti seri Applied Biosystems 3730 dan 3500 mencapai panjang baca 600–1000 basa per analisis dengan akurasi penentuan basa melebihi 99,99% pada tingkat konsensus. Sekuensing Sanger berbasis CGE tetap menjadi standar emas untuk validasi sekuens, deteksi mutasi, dan sekuensing diagnostik klinis, meskipun sekuensing generasi berikutnya mendominasi proyek penemuan skala besar.
Aplikasi dalam Pembuatan Profil DNA Forensik
Pembuatan profil DNA forensik bergantung pada pemisahan CGE dari lokus pengulangan tandem pendek (STR) yang diamplifikasi PCR. Kit multipleks komersial mengamplifikasi 15 hingga 27 penanda STR ditambah penanda penentu jenis kelamin amelogenin dalam satu reaksi. Amplikon berlabel fluoresen dipisahkan oleh CGE dengan deteksi LIF multi-warna, dan ukuran alel ditentukan dengan perbandingan terhadap standar ukuran internal. Daya pisah CGE — lebih baik dari satu pasang basa dalam rentang ukuran 100–500 bp — memungkinkan diskriminasi alel yang berbeda hanya satu unit pengulangan (4 bp untuk pengulangan tetranukleotida). Profil DNA yang dihasilkan dicocokkan dengan basis data nasional dan internasional untuk identifikasi manusia. CGE juga digunakan dalam sekuensing DNA mitokondria dan dalam analisis STR kromosom Y dan kromosom X untuk aplikasi forensik khusus. Otomatisasi, throughput, dan reprodusibilitas CGE telah menjadikannya platform universal untuk analisis DNA forensik di seluruh dunia.
Aplikasi dalam Analisis Protein
SDS-CGE adalah alternatif otomatis dan kuantitatif terhadap SDS-PAGE gel lempeng untuk penentuan ukuran protein dan analisis kemurnian. Protein didenaturasi dengan SDS dan agen pereduksi, diberi label dengan pewarna fluoresen (untuk deteksi LIF) atau dideteksi dengan serapan UV, dan dipisahkan dalam matriks polimer linier. Waktu migrasi setiap protein dikonversi menjadi berat molekul menggunakan kurva kalibrasi yang dihasilkan dari standar protein. SDS-CGE menawarkan beberapa keunggulan dibandingkan elektroforesis gel lempeng: waktu analisis 30–60 detik per sampel dalam format mikrofluida atau 5–15 menit dalam sistem kapiler, kuantifikasi yang presisi dari kelimpahan relatif protein melalui integrasi luas puncak, dan kopling langsung dengan spektrometri massa untuk identifikasi protein. Ini banyak digunakan dalam kontrol kualitas biofarmasi untuk memantau kemurnian produk, profil glikosilasi, dan fragmentasi protein terapeutik dan antibodi. Rentang ukuran protein SDS-CGE mencakup sekitar 10–250 kDa, dengan resolusi yang cukup untuk membedakan spesies protein yang berbeda 5–10% dalam berat molekul.
Perbandingan dengan Elektroforesis Gel Lempeng
CGE menawarkan keunggulan mendasar dibandingkan elektroforesis gel lempeng tradisional. Format kapiler menyediakan disipasi panas yang efisien, memungkinkan kekuatan medan listrik yang lebih tinggi dan pemisahan yang lebih cepat. Deteksi dilakukan on-column secara real-time, menghilangkan langkah pewarnaan, penghilangan warna, dan pencitraan yang diperlukan untuk gel lempeng. Matriks polimer yang dapat diganti menghindari pekerjaan penuangan gel dan memungkinkan operasi multi-analisis otomatis. Kuantifikasi lebih akurat karena deteksi bersifat linier pada rentang dinamis yang luas dan luas puncak diintegrasikan secara elektronik. Namun, gel lempeng tetap berguna untuk pemisahan preparatif di mana pita individu harus dipotong, untuk alur kerja elektroforesis dua dimensi (2D-PAGE), dan untuk laboratorium di mana biaya modal instrumen CGE terlalu mahal. CGE dan elektroforesis gel lempeng adalah alat yang saling melengkapi, dan pilihan di antara keduanya tergantung pada persyaratan throughput, kuantifikasi, dan otomatisasi dari aplikasi spesifik.
