Isotakoforesis kapiler (CITP) adalah teknik pemisahan elektroforetik khusus yang menggunakan sistem penyangga diskontinu yang terdiri dari elektrolit pemimpin (LE) dan elektrolit penghenti (TE) untuk memfokuskan analit bermuatan ke dalam zona yang terdefinisi dengan tajam dan berdekatan. Semua zona analit bermigrasi dengan kecepatan yang sama, ditentukan oleh ion pemimpin, suatu kondisi yang dikenal sebagai keadaan isotakoforetik. CITP menawarkan kemampuan unik untuk konsentrasi sampel, pemurnian, dan prakonsentrasi sebelum analisis hilir, dan sangat berharga untuk pengayaan jejak analit ionik dari sampel encer. Tidak seperti elektroforesis zona, di mana analit terpisah menjadi zona diskrit yang melebar seiring waktu, isotakoforesis mengompresi dan mempertahankan zona sempit selama pemisahan berlangsung, menghasilkan konsentrasi analit lokal yang tinggi yang meningkatkan sensitivitas deteksi.
Sistem penyangga diskontinu
Persyaratan mendasar untuk isotakoforesis adalah penggunaan dua sistem penyangga yang berbagi kontra-ion yang sama tetapi berbeda dalam mobilitas efektifnya. Elektrolit pemimpin mengandung ion dengan mobilitas efektif tertinggi di antara semua spesies ionik dalam sistem, sedangkan elektrolit penghenti mengandung ion dengan mobilitas efektif terendah. Sampel dimasukkan di antara kedua elektrolit ini. Ketika medan listrik diterapkan, ion pemimpin bergerak paling cepat dan menetapkan kecepatan migrasi untuk seluruh sistem. Ion dengan mobilitas antara mengatur diri mereka dalam urutan menurun mobilitas antara zona pemimpin dan penghenti. Semua zona kemudian bermigrasi dengan kecepatan yang sama, diatur oleh ion pemimpin, dan tetap saling bersentuhan tanpa celah. Konsentrasi setiap analit menyesuaikan secara otomatis sesuai dengan fungsi pengatur Kohlrausch, yang menyatakan bahwa produk konsentrasi dan mobilitas konstan dalam setiap zona dalam kondisi tunak.
Mekanisme pemfokusan dan penajaman zona
Efek penajaman mandiri adalah karakteristik yang mendefinisikan isotakoforesis. Jika suatu ion analit berdifusi ke zona tetangga di mana medan listrik berbeda, ia mengalami gaya yang mengembalikannya ke zonanya sendiri. Ion yang menyimpang ke zona dengan kekuatan medan lebih tinggi berakselerasi hingga mereka memasuki kembali zona yang benar, sementara yang memasuki zona dengan kekuatan medan lebih rendah melambat. Pemfokusan dinamis ini melawan difusi dan menghasilkan batas zona yang sangat tajam. Konsentrasi analit dalam setiap zona ditentukan oleh konsentrasi dan mobilitas ion pemimpin, bukan oleh konsentrasi sampel awal. Sifat unik ini memungkinkan CITP untuk memekatkan analit dengan faktor 100 hingga 1000 atau lebih, menjadikannya alat yang ampuh untuk analisis jejak.
Instrumentasi dan pertimbangan praktis
CITP dapat dilakukan dalam instrumentasi elektroforesis kapiler yang sama yang digunakan untuk mode pemisahan lainnya, asalkan sistem dapat mengakomodasi konfigurasi penyangga diskontinu. Kapiler silika leburan diisi dengan elektrolit pemimpin, diikuti oleh injeksi sampel dan kemudian pengenalan elektrolit penghenti di reservoir masukan. Catu daya arus konstan biasanya lebih disukai daripada operasi tegangan konstan karena arus tetap stabil selama pemisahan, sedangkan tegangan berubah saat zona dengan konduktivitas berbeda melewati kapiler. Deteksi umumnya dilakukan menggunakan detektor konduktivitas, yang merespons perubahan konduktivitas zona, atau detektor absorbansi UV-Vis yang diposisikan di outlet kapiler. Pembentukan zona yang stabil dan reprodusibel memerlukan pemilihan komposisi elektrolit pemimpin dan penghenti yang cermat, termasuk pemilihan kontra-ion, pH, dan penambahan agen pengompleks atau pelarut organik untuk menyesuaikan selektivitas.
Penggabungan dengan elektroforesis zona kapiler
Salah satu aplikasi terpenting CITP adalah sebagai langkah prakonsentrasi dalam jaringan sebelum elektroforesis zona kapiler (CZE). Dalam konfigurasi CITP-CZE tergabung, segmen pertama kapiler digunakan untuk pemfokusan isotakoforetik volume sampel yang besar, sedangkan segmen kedua melakukan pemisahan elektroforesis zona dari pita analit yang terfokus. Sakelar konduktivitas atau tegangan digunakan untuk mentransfer zona yang ditumpuk dari tahap CITP ke tahap CZE. Pendekatan ini dapat meningkatkan sensitivitas deteksi dua hingga tiga orde magnitudo dibandingkan dengan injeksi CZE konvensional, memungkinkan deteksi komponen jejak pada konsentrasi dalam kisaran nanomolar. Teknik hibrida CITP-CZE telah diterapkan pada analisis peptida, protein, nukleotida, pengotor farmasi, kontaminan lingkungan, dan aditif makanan.
Aplikasi dalam bioanalisis
CITP telah banyak digunakan dalam bidang bioanalitik untuk prakonsentrasi dan pembersihan sampel biologis yang kompleks. Dalam proteomik, CITP digunakan untuk memekatkan digest protein encer dan menghilangkan garam dan penyangga berkelimpahan tinggi yang akan mengganggu deteksi spektrometri massa. Teknik ini telah diintegrasikan dengan alur kerja elektroforesis kapiler-spektrometri massa (CE-MS) untuk meningkatkan deteksi peptida berkelimpahan rendah dan modifikasi pascaterjemahan. Dalam kimia klinis, CITP digunakan untuk penentuan asam organik dalam urin, pemantauan metabolit obat dalam plasma, dan skrining untuk kesalahan metabolisme bawaan. Kemampuan untuk memproses volume injeksi besar tanpa kehilangan resolusi membuat CITP sangat cocok untuk sampel di mana analit yang diminati hadir pada tingkat jejak dalam matriks yang kompleks.
Tren terkini dan arah masa depan
Perkembangan terbaru dalam CITP mencakup miniaturisasi pada chip mikrofluida, di mana pemfokusan isotakoforetik digunakan untuk memekatkan analit dalam jaringan mikrokanal untuk integrasi dengan perangkat laboratorium-on-a-chip. Kemajuan dalam desain elektrolit, termasuk penggunaan penyangga zwitterionik dan sistem pelarut non-air, telah memperluas kisaran analit yang dapat menjalani analisis isotakoforetik. Pemodelan komputasional dari proses isotakoforetik sekarang memungkinkan optimasi rasional komposisi penyangga dan kondisi pemisahan. CITP terus berkembang sebagai teknik pelengkap dalam perangkat elektroforesis kapiler yang lebih luas, dihargai karena kekuatan pemekatannya yang unik dan kemampuannya untuk menangani matriks sampel yang menantang yang ditemui dalam pemantauan lingkungan, keamanan pangan, pengembangan farmasi, dan diagnostik klinis.
