Mengetahui berapa banyak sel hidup yang Anda miliki dan seberapa cepat mereka membelah sangat penting untuk kultur sel yang reprodusibel dan eksperimen farmakologi.

Penghitungan Hemositometer

Hemositometer adalah kaca objek mikroskop khusus dengan dua ruang penghitungan terukir, masing-masing berisi kisi dengan dimensi yang diketahui. Kisi terdiri dari sembilan kotak 1 × 1 mm, masing-masing terbagi menjadi 16 kotak yang lebih kecil. Kedalamannya 0,1 mm, memberikan volume 0,1 µL per kotak 1 mm².

1. Campur suspensi sel secara menyeluruh untuk memastikan sel tunggal.
2. Campur 10 µL suspensi sel dengan 10 µL trypan blue 0,4% (untuk viabilitas).
3. Muat 10 µL campuran ke dalam ruang hemositometer.
4. Hitung sel di empat kotak sudut 1 mm² (setidaknya 100 sel total untuk signifikansi statistik).
5. Hitung: sel/mL = (rata-rata hitungan per kotak) × faktor pengenceran × 10⁴.

Eksklusi Trypan Blue

Trypan blue diekskresikan oleh sel hidup dengan membran utuh tetapi masuk ke sel mati, mewarnainya biru. Viabilitas = (sel hidup / total sel) × 100%. Viabilitas yang dapat diterima untuk sebagian besar eksperimen adalah >90%.

Penghitung Sel Otomatis

Penghitung otomatis (Countess, Vi-CELL, Cellometer) menggunakan trypan blue dan analisis gambar digital untuk menghitung ratusan sel dalam hitungan detik. Mereka mengurangi variabilitas antar operator dan menyediakan data distribusi ukuran. Sebagian besar juga menghitung viabilitas dan dapat menandai gumpalan sel. Kalibrasi penghitung otomatis terhadap hitungan hemositometer manual secara berkala.

Uji Viabilitas dan Sitotoksisitas

Selain trypan blue, beberapa uji berbasis plat menilai viabilitas dan sitotoksisitas dalam format multi-sumur:

• Uji MTT/MTS: dehidrogenase mitokondria dalam sel hidup mereduksi pewarna tetrazolium menjadi formazan berwarna (absorbansi pada 490–570 nm). Sinyal sebanding dengan jumlah sel yang aktif secara metabolik.
• Resazurin (Alamar Blue): sel hidup mereduksi resazurin menjadi resorufin fluoresen. Tidak toksik — sel yang sama dapat diukur dari waktu ke waktu.
• Uji pelepasan LDH: laktat dehidrogenase yang dilepaskan dari sel yang rusak ke dalam medium diukur secara enzimatik (absorbansi pada 490 nm). Mengukur sitotoksisitas secara langsung.
• Uji ATP (CellTiter-Glo): pengukuran berbasis luciferase dari ATP seluler. Sangat sensitif dan linier pada rentang dinamis yang luas.

Uji Proliferasi

• Kurva pertumbuhan: hitung sel setiap hari selama 5–7 hari dan plot log jumlah sel vs. waktu. Waktu penggandaan dihitung dari fase eksponensial.
• Inkorporasi BrdU/EdU: analog nukleosida yang diinkorporasi ke dalam DNA selama fase-S dideteksi oleh pewarnaan antibodi (BrdU) atau kimia klik (EdU). Diukur dengan flow cytometry, mikroskopi fluoresensi, atau ELISA.
• Uji SRB (sulforhodamine B): mewarnai protein seluler. Sel yang difiksasi diwarnai dengan SRB, dan pewarna yang terikat dilarutkan dan diukur pada 510 nm. Linearitas dan stabilitas yang sangat baik.