Analisis siklus sel mengkuantifikasi proporsi sel dalam setiap fase siklus pembelahan sel. Metode yang paling umum mengukur kandungan DNA dengan sitometri alir.

Analisis Kandungan DNA dengan Sitometri Alir

Sel difiksasi dan dipermeabilisasi, kemudian diwarnai dengan pewarna DNA stokiometrik. Intensitas fluoresensi sebanding dengan kandungan DNA:

• G0/G1: kandungan DNA diploid (2N).
• Fase S: kandungan DNA antara 2N dan 4N (sintesis DNA berlangsung).
• G2/M: kandungan DNA tetraploid (4N).

Asumsi kuncinya adalah pewarna mengikat DNA secara proporsional dengan massa. Propidium iodida (PI) adalah pewarna DNA yang paling umum untuk sel yang difiksasi, tetapi ia juga mengikat RNA. Langkah perlakuan RNase A atau RNase T1 sangat penting.

Protokol propidium iodida:

1. Panen 1×10⁶ sel dan cuci dengan PBS.
2. Fiksasi dalam etanol 70% pada −20 °C selama setidaknya 2 jam (dapat disimpan berminggu-minggu).
3. Cuci dengan PBS untuk menghilangkan etanol (vortex selama pencucian untuk mencegah penggumpalan).
4. Resuspensi dalam buffer pewarnaan PI/RNase (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A dalam PBS, 0,1% Triton X-100).
5. Inkubasi pada 37 °C selama 30 menit dalam gelap.
6. Analisis dengan sitometri alir (skala linier, eksitasi 488 nm, emisi >575 nm).
7. Kumpulkan setidaknya 10.000 peristiwa pada laju alir lambat untuk CV terbaik.

Analisis Data

Histogram kandungan DNA menunjukkan puncak pada 2N dan 4N dengan dataran fase S di antaranya. Perangkat lunak pemodelan (FlowJo, ModFit, FCS Express) menyesuaikan model matematika ke data:

• Puncak G0/G1 dan G2/G2 dimodelkan sebagai distribusi Gaussian (CV = 2–5% untuk data berkualitas tinggi).
• Fase S dimodelkan sebagai persegi panjang lebar atau polinomial dengan kemiringan meningkat dari 2N ke 4N.
• Debris dan agregat dimodelkan oleh kurva debris (eksponensial) dan puncak agregat (pada 6N, 8N, dll.).

CV >8% pada puncak G0/G1 menunjukkan data berkualitas buruk, gumpalan sel, perlakuan RNase tidak lengkap, atau laju alir terlalu tinggi.

Inkorporasi BrdU

Bromodeoksiuridin (BrdU) adalah analog timidin yang diinkorporasi ke dalam DNA selama fase S. Setelah pelabelan (30–60 menit), sel difiksasi, dipermeabilisasi, dan diwarnai dengan antibodi anti-BrdU. DNA diwarnai balik dengan 7-AAD atau DAPI. Sitometri alir dengan analisis parameter ganda (BrdU vs. kandungan DNA) membedakan:

• G0/G1: BrdU rendah, DNA 2N.
• Fase S: BrdU tinggi, DNA intermediet.
• G2/M: BrdU rendah, DNA 4N.
• G0: BrdU sangat rendah, DNA 2N (G0 berkepanjangan dapat dibedakan dari G1 dengan pewarnaan Ki-67).

Pewarnaan BrdU memerlukan denaturasi parsial DNA (HCl atau DNase I) untuk mengekspos BrdU yang terinkorporasi ke antibodi, yang menurunkan integritas DNA dan dapat memperlebar histogram kandungan DNA. EdU, analog BrdU yang dideteksi oleh kimia klik berkatalis tembaga, menghindari langkah denaturasi dan mempertahankan analisis kandungan DNA berkualitas tinggi.

Indeks Mitotik

Sel dalam mitosis (fase M) dapat diidentifikasi dengan pewarnaan untuk histon H3 terfosforilasi pada Ser10 (p-H3S10). Modifikasi ini spesifik untuk sel mitosis. Dikombinasikan dengan analisis kandungan DNA, pewarnaan p-H3S10 memisahkan sel mitosis dari populasi G2/M yang lebih luas.

Perangkap Umum

• Doublet: dua sel G1 yang melewati laser bersama-sama terdaftar sebagai satu peristiwa G2/M. Gunakan gate diskriminasi doublet (FL2-A vs. FL2-W) untuk mengecualikannya.
• Populasi hipodiploid (sub-G1): sel dengan kandungan DNA <2N bersifat apoptosis atau nekrotik. Jika >10% peristiwa adalah sub-G1, kondisi kultur mungkin menginduksi kematian sel.
• Fiksasi: fiksasi metanol memberikan resolusi kandungan DNA yang lebih baik daripada etanol tetapi tidak kompatibel dengan semua penanda permukaan sel.