Sinkronisasi sel adalah proses membawa semua sel dalam kultur ke fase siklus sel yang sama. Ini memungkinkan studi yang bergantung pada siklus sel tanpa metode resolusi sel tunggal.

Metode Kimia

Blok Timidin. Kelebihan timidin (2 mM) menghambat ribonukleotida reduktase, menghabiskan pool dCTP dan menghentikan sintesis DNA. Sel terakumulasi pada batas G1/S. Blok tunggal menghentikan sebagian besar sel pada G1/S dalam 12–24 jam. Blok timidin ganda (blok 16–18 jam, lepaskan 8–10 jam, blok lagi 16–18 jam) mencapai >90% sinkronisasi pada G1/S. Blok kedua menangkap sel yang melewati fase-S selama pelepasan pertama.

Pelepasan dilakukan dengan mencuci timidin dengan medium segar. Setelah pelepasan, populasi bergerak secara sinkron melalui fase S, G2, dan M. Sinkroni menurun dengan setiap siklus sel karena variasi alami dalam laju progresi siklus sel.

Hidroksiurea. Menghambat ribonukleotida reduktase mirip dengan timidin. Digunakan pada 1–2 mM selama 12–24 jam. Hidroksiurea kurang toksik dibandingkan timidin dan menghentikan sel pada batas G1/S dengan reversibilitas yang baik. Kerugian utama adalah menyebabkan kerusakan DNA (stres replikasi), yang dapat membingungkan eksperimen yang mempelajari respons kerusakan DNA.

Nokodazol. Mendepolimerisasi mikrotubulus, menghentikan sel pada fase M di checkpoint metafase–anafase (checkpoint perakitan spindel). Digunakan pada 50–100 ng/mL selama 12–18 jam. Indeks mitosis dapat mencapai >90%. Sel mitosis membulat dan terlepas dari permukaan kultur, dapat dipanen dengan shake-off tanpa trypsinisasi, metode yang disebut mitotic shake-off. Pelepasan cepat (sel keluar dari mitosis dalam 30–60 menit setelah pencucian) tetapi penghentian menjadi toksik jika diperpanjang melebihi 18 jam.

Kolkisin. Mekanisme mirip dengan nokodazol tetapi lebih toksik dan kurang reversibel. Digunakan pada 50–100 ng/mL. Kolkisin lebih umum digunakan untuk persiapan sitogenetik (penyebaran kromosom) daripada untuk uji fungsional.

Mimosin. Asam amino tanaman yang menghambat inisiasi replikasi DNA, menghentikan sel pada G1 akhir (bukan pada G1/S). Digunakan pada 0,5–2 mM selama 12–24 jam. Mimosin kurang umum digunakan dibandingkan timidin tetapi memiliki keuntungan menghentikan pada G1 daripada pada batas G1/S, yang berguna untuk mempelajari peristiwa G1 awal.

Starvasi Serum

Menghilangkan serum dari medium kultur selama 24–72 jam mendorong sel ke G0 (quiescence). Setelah penambahan kembali serum, sel masuk kembali ke siklus sel pada G1. Metode ini sederhana dan banyak digunakan untuk sel primer dan fibroblas. Efisiensi sinkronisasi G0/G1 bervariasi menurut tipe sel, sel HEK 293 sebagian besar tidak terpengaruh oleh starvasi serum, sementara NIH 3T3 berhenti secara efektif.

Starvasi serum menyebabkan perubahan global dalam metabolisme, pensinyalan (mTOR, MAPK), dan ekspresi gen yang tidak terbatas pada penghentian siklus sel. Ini tidak boleh digunakan untuk eksperimen di mana baseline metabolik atau pensinyalan sangat penting.

Metode Fisik

Mitotic shake-off. Selama blok nokodazol atau bahkan dalam pertumbuhan logaritmik, sel mitosis membulat dan terlepas. Ketukan lembut pada labu kultur melepaskannya ke dalam medium. Sel yang dipanen >95% mitosis dan dapat ditanam kembali untuk progresi sinkron ke G1. Hasilnya rendah (1–3% dari populasi) dan metode ini hanya bekerja untuk sel adheren.

Elutriasi sentrifugal. Sel dipisahkan berdasarkan ukuran dalam sentrifugasi arus berlawanan, sel besar (G2/M) mengendap lebih cepat, sel kecil (G1) terelusi lebih dulu. Metode ini memerlukan peralatan khusus (Beckman JE-5.0 atau sejenisnya) tetapi menghasilkan populasi sinkron tanpa gangguan kimia. Ini bekerja untuk sel adheren dan suspensi dan dapat menghasilkan 10⁸–10⁹ sel tersinkronisasi per putaran.

Fluorescence-activated cell sorting (FACS). Sel yang diwarnai dengan pewarna DNA vital (Hoechst 33342) dipilah menjadi populasi G1, S, dan G2/M. Metode ini menghasilkan populasi dengan kemurnian sangat tinggi (>99%) tetapi proses pemilahan bersifat menekan, dan hasilnya rendah (10⁶–10⁷ sel per jam).

Verifikasi

Efisiensi sinkronisasi harus diverifikasi, biasanya dengan analisis siklus sel menggunakan pewarnaan DNA propidium iodida dan flow cytometry. Fraksi sel dalam fase target harus >80–90% untuk sinkronisasi yang berhasil. Untuk sinkronisasi mitosis, pewarnaan p-H3S10 digunakan.

Memilih Metode

Metode kimia adalah yang paling mudah diakses tetapi dapat memperkenalkan artefak. Metode fisik menghindari bahan kimia tetapi memerlukan peralatan khusus atau menghasilkan lebih sedikit sel.