Siklus asam sitrat, juga dikenal sebagai siklus Krebs atau siklus TCA, adalah pusat metabolisme sel. Ini terjadi di matriks mitokondria dan menyelesaikan oksidasi karbohidrat, lemak, dan protein dengan mengubah asetil-KoA menjadi karbon dioksida.
Cara Kerja Siklus Asam Sitrat
- Entri: Formasi Sitrat
Asetil-KoA (berasal dari piruvat, asam lemak, atau asam amino) bergabung dengan oksaloasetat, molekul empat karbon, membentuk sitrat, molekul enam karbon. Reaksi ini dikatalisis oleh sitrat sintase dan pada dasarnya tidak dapat diubah.
- Isomerisasi dan Oksidasi Pertama
Sitrat diisomerisasi menjadi isositrat melalui perantara cis-aconitate. Isositrat kemudian dioksidasi oleh isositrat dehidrogenase, melepaskan molekul pertama CO2 dan menghasilkan NADH. Produknya adalah alfa-ketoglutarat, molekul lima karbon.
- Oksidasi Kedua
Alfa-ketoglutarat dioksidasi oleh alfa-ketoglutarat dehidrogenase, melepaskan CO2 kedua dan menghasilkan NADH. Reaksi ini mirip dengan reaksi piruvat dehidrogenase dan menghasilkan suksinil-KoA.
- Fosforilasi Tingkat Substrat
Suksinil-KoA diubah menjadi suksinat oleh suksinil-KoA sintetase. Reaksi ini menghasilkan GTP (atau ATP pada beberapa organisme) melalui fosforilasi tingkat substrat—satu-satunya langkah langsung yang menghasilkan ATP dalam siklus tersebut.
- Regenerasi Oksaloasetat
Suksinat dioksidasi menjadi fumarat oleh suksinat dehidrogenase, menghasilkan FADH2. Fumarat kemudian dihidrasi menjadi malat, dan malat dioksidasi menjadi oksaloasetat oleh malat dehidrogenase, menghasilkan NADH lain. Oksaloasetat yang diregenerasi siap untuk bergabung dengan asetil-KoA lainnya.
- Hasil Bersih per Putaran
Setiap pergantian siklus menghasilkan:
- 3 NADH
- 1 FADH2
- 1 GTP (atau ATP)
- 2 CO2
Pengukuran Praktis Intermediate Siklus TCA
Zat antara siklus TCA dapat diukur dengan spektrometri massa kromatografi cair (LC-MS) untuk menilai fluks metabolisme. Panen sel (1–5 × 10⁶) atau jaringan (10–50 mg) dengan pendinginan cepat dalam metanol 80% dingin untuk menghentikan metabolisme. Tambahkan campuran standar internal yang mengandung isotopolog sitrat, suksinat, fumarat, malat, dan alfa-ketoglutarat berlabel ¹³C (masing-masing 1 nmol). Ekstrak metabolit dengan tiga siklus beku-cair dalam metanol 80%, sentrifugasi pada 15.000 × g selama 10 menit pada suhu 4°C, dan keringkan supernatan di bawah gas nitrogen. Susun kembali dalam 50 µL air dan suntikkan 5 µL ke kolom C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 µm) yang digabungkan ke triple quadrupole MS yang dioperasikan dalam mode ion negatif. Pisahkan dengan gradien air (asam format 0,1%) dan asetonitril dengan kecepatan 0,3 mL/menit selama 15 menit. Pantau transisi MRM spesifik: sitrat (191 → 111 m/z), suksinat (117 → 73 m/z), fumarat (115 → 71 m/z), malat (133 → 115 m/z), dan alfa-ketoglutarat (145 → 101 m/z). Untuk analisis fluks, inkubasi sel dengan glukosa [U-¹³C] selama 6 jam; pola pelabelan pada zat antara TCA menunjukkan kontribusi relatif glukosa vs. glutamin sebagai sumber karbon. Sebagai alternatif, gunakan inhibitor kimia sebagai pemeriksaan metabolik - fluorositrat (10–50 µM) menghambat aconitase, menghalangi siklus sitrat dan menyebabkan akumulasi sitrat yang dapat diukur dengan LC-MS dalam waktu 2 jam.
Aplikasi Dunia Nyata
Dalam studi cedera reperfusi iskemia pada jantung tikus, siklus TCA diukur dengan LC-MS. Dibandingkan dengan kontrol, jantung iskemik menunjukkan penurunan suksinat sebesar 60% dan peningkatan fumarat 3 kali lipat, yang menunjukkan disfungsi Kompleks II. Setelah reperfusi, ledakan oksidasi suksinat berkontribusi terhadap produksi spesies oksigen reaktif. Temuan ini menghubungkan gangguan siklus TCA dengan cedera jantung dan menyarankan suksinat sebagai target terapi.
