Mikroskopi pemindaian laser konfokal (CLSM) adalah teknik pencitraan optik yang meningkatkan resolusi dan kontras dengan menghilangkan cahaya di luar fokus. Bukaan lubang jarum yang ditempatkan di depan detektor memblokir cahaya dari bidang di atas dan di bawah bidang fokus, sehingga hanya cahaya dari titik fokus yang mencapai detektor. Kemampuan pemotongan optik ini memungkinkan pencitraan spesimen tebal dan rekonstruksi tiga dimensi.
Dalam mikroskop konfokal, sinar laser diperluas dan diarahkan melalui lensa objektif ke titik terbatas difraksi dalam spesimen. Molekul fluoresen dalam volume fokus tereksitasi dan memancarkan cahaya yang dikumpulkan oleh objektif yang sama. Cermin dikroik memisahkan jalur eksitasi dan emisi, dan bukaan lubang jarum variabel di bidang gambar konjugat menolak emisi di luar fokus. Tabung fotomultiplier atau fotodioda longsor mendeteksi sinyal.
Sinar dipindai raster melintasi spesimen menggunakan cermin galvanometer, membangun gambar piksel demi piksel. Kecepatan pindaian biasanya berkisar 0,5–4 bingkai per detik pada 512×512 piksel. Pemindai resonan mencapai pencitraan kecepatan video untuk aplikasi sel hidup.
Resolusi lateral mikroskopi konfokal sekitar 0,2 µm, dan resolusi aksial sekitar 0,5 µm dengan objektif bukaan numerik tinggi. Resolusi tergantung pada panjang gelombang eksitasi dan bukaan numerik objektif. Diameter lubang jarum diatur ke 0,5–1 unit Airy untuk menyeimbangkan resolusi dan intensitas sinyal.
Pencitraan multi-saluran secara berurutan mengeksitasi beberapa fluorofor menggunakan garis laser yang berbeda dan mendeteksi emisi melalui detektor terpisah atau saluran spektral. Fluorofor umum meliputi DAPI, FITC, TRITC, Cy3, Cy5, dan pewarna Alexa. Pemisahan spektral memisahkan spektrum emisi yang tumpang tindih.
Akuisisi tumpukan-Z mengumpulkan serangkaian bagian optik pada kedalaman fokus yang berbeda. Proyeksi intensitas maksimum dan rendering volume merekonstruksi struktur tiga dimensi. Pencitraan gerak lambat menangkap proses dinamis dalam spesimen hidup. FRAP (pemulihan fluoresensi setelah pemutihan foto) mengukur mobilitas molekuler. Fotoaktivasi dan fotokonversi melacak subpopulasi tertentu.
Aplikasi mencakup biologi sel, neurobiologi, biologi perkembangan, dan ilmu material. CLSM mencitrakan organisasi sitoskeleton, sinyal intraseluler, dinamika membran, dan lokalisasi subseluler dalam sel tetap dan hidup. Dalam ilmu material, CLSM mengkarakterisasi topografi permukaan, ketebalan lapisan, dan distribusi partikel.
